人毛囊干细胞中分离纯化检测方案

Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery， February 2008，Vol. 22， No.2·202· 中国修复重建外科杂志2008年2月第22卷第2期·203· 显微分离培养与免疫磁珠法分离纯化人毛囊干细胞 谭挺 胡志奇 周洪军 【摘 要】 目的 探讨从人毛囊隆突区细胞(bulge cells， BCs)获取高纯度有活性的人毛囊干细胞(hair folliclestem cells， HFSCs)的方法及条件。 方法 取自愿捐献的成人头皮标本，显微分离培养获得 BCs，应用免疫磁珠纯化BCs 中 CD200 阳性的 HFSCs。苔盼蓝染色比较纯化前后细胞活性；流式细胞仪检测细胞纯化效率；免疫荧光检测纯化前后细胞 CD200 的表达情况。 结果 显微分离培养获得的人毛囊 BCs，培养6d后细胞生长融合，呈铺路石样。所得细胞角蛋白19组织化学染色阳性。 CD200 免疫磁珠分选法纯化细胞后，苔盼蓝染色显示纯化前细胞活力为95.0%±0.6%，纯化后为94.2%±1.0%，差异无统计学意义(P>0.05)。流式细胞仪及免疫荧光检测显示纯化前 CD200 阳性细胞的纯度为 8.31%，纯化后 CD200阳性细胞纯度为82.31%，纯化后CD200 阳性细胞回收率为65.39%。 结论 联用显微分离培养与免疫磁珠法，可获得高纯度 HFSCs，且细胞活性不受影响。 【关键词】 毛囊干细胞 免疫磁珠细胞分选 显微分离培养 纯化 中图分类号：：R329.28 Q813 文献标志码：A SEPARATION AND PURIFICATION OF HUMAN HAIR FOLLICLE STEM CELLS BY MICROMANIPULATIONAND MAGNETIC CELL SORTING/TAN Ting， HU Zhiqi， ZHOU Hongjun. Department of plastic surgery， Nanfang Hospital，Southern Medical University， Guangzhou Guangdong， 510515， P.R.China.Corresponding author： HU Zhiqi， E-mail： doctorhzq@hotmail.com 【Abstract】 Objectivee To improve the method of obtaining purified and viable human hair follicle stem cells (HFSCs)from bulge cells (BCs).Methods Firstly， the BCs were isolated from human hair follicles by microdissection. Secondly， theCD200*HFSCs were selected from BCs using magnetic cell sorting method. The viability of these purified HFSCs was detectedunder light microscope. The purification rate was analyzed by flow cytometry. The pre- and post-purification cells were comparedby immunofluorescence staining.Results The adherent BCs displayed a typical cobblestone morphology on day 6. The BCs ex-pressed K19 strongly. The viabil ity rate of pre-purification cells was 95.0% ±0.6% while that of post- purification cells was 94.2% ±1.0%. There was no significant difference (P <0.05). By flow cytometry and immunofluorescence staining examination， the CD200*cell rate was 8.31% before cell sorting purification while that was 82.31% after cell sorting purification. Conclusion Highly pu-rified and viable HFSCs could be obtained by micromanipulation and magnetic cell sorting assay. 【key words】 Hair follicle stem cells Immunomagnetic cell sorting Micromanipulation Purification Foundation item： Science and Technology Planning Project of Guangdong Province(2005B34001005) 毛发的周期性自我更新以及生长依赖于毛囊干细胞(hair follicle stem cells， HFSCs)周期性增殖和分化凹。目前研究认为 HFSCs 定位于毛囊外根鞘的隆突区，大致是毛囊外根鞘最外层靠近立毛肌附着点处[2-3]。研究 HFSCs 对于秃发的发病机制、毛囊组织工程以及干细胞或基因治疗秃发方面均有重要理论和临床意义。而目前干细胞研究首先要解决的是干细胞纯化培养的问题，我们的实验联合采用显微分离培养与免疫磁珠法，从而获得高纯度、有活性的人HFSCs。报告如下。 ( 基金项目：广东 省 科技计划项目资助(2005B34001005) ) ( 作 者 单位：南方医科大学南方医院整形外科(广州，510515) ) ( 通讯作者：胡志奇，教授，研究方向：毛囊生物学和毛囊组织工程， E -mail： doctorhzq@hotmail.com ) 1 材料与方法 1.1 实验标本 获取自愿捐献的成人枕、颞部正常全层头皮标本20例。男12例，女8例。年龄20~53岁。所取标本面积平均约4cm²，标本均于取材后4h内处理。 1.2 主要试剂及仪器 羊抗鼠 IgG 免疫磁珠(Dynal公司，挪威)； FITC标记的鼠抗人 CD200单抗(Serotec公司，英国)；DMEM/F12 培养基(Hyclone 公司，美国)；FBS、氢化可的松、EGF、牛胰岛素、青、链霉素、Dispase 分离酶、PBS缓冲液、D-Hank’s 液(Sigma 公司，美国)；胰酶(Biosource公司，美国)；角蛋白19 (Keratin 19， K19)单克隆抗体(迈新生物技术有限公司)；即用型ABC 试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。BD FACSCalibur 流式细 胞仪、体视显微镜、相差显微镜、荧光显微镜(Olympus公司，日本)；磁珠分离器(Dynal公司，挪威)。 1.3 实验方法 1.3.1 人毛囊隆突区细胞(bulge cells， BCs)分离与培养 取头皮标本，参照显微分离培养法[4]并加以改进，备皮后以70%乙醇清洗，尽量除去皮下脂肪。将皮片切成长条，置入 0.25%Dispase 分离酶，37℃消化2h。用镊子从脂肪端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，体视显微镜下分别在球部上端、皮脂腺下端横切毛囊，取中间部分，含双抗 PBS 漂洗3次，置于25mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基(DMEM/F12、10%FBS、5 ug/mL氢化可的松、10ng/mL EGF、5 ug/mL 牛胰岛素及1%青、链霉素)，于37℃、5% CO，孵箱中培养，每3天换液，观察细胞增殖能力及形态学特征。 1.3.2 人毛囊 BCs 鉴定 取少量 BCs 置于培养皿中，48h 重新贴壁后， PBS 漂洗3次，每次5min，预冷丙酮固定10 min，常规免疫细胞化学方法染色，检测K19的表达情况，以 PBS代替一抗作阴性对照。 1.3.3 制备细胞悬液 当BCs接近 80%融合时，去除 培养基，含双抗 PBS清洗2次，加入0.125%胰蛋白酶， 37℃消化8 min，加入同样体积培养基终止消化，反复 吹打，200目筛网过滤，离心半径12 cm， 1 500 r/min离心5 min， 重新用 DMEM/F12补充培养基悬浮细胞。1.3.4 人HFSCs纯化 将重悬的细胞调整为1×10/mL，按 1.0 ug/mL 加入 FITC 标记的鼠抗人CD200单抗，室温孵育30 min。离心半径 12 cm，1 000 r/min离心5 min， 弃上清中未结合的抗体。加入1mL磁珠分选缓冲液重悬细胞，离心半径12 cm， 1 000 r/min离心5 min 弃上清， PBS 缓冲液清洗2次，离心半径 12 cm， 1 500 r/min 离心 5 min。取重悬后 BCs 与50 ug免疫磁珠混合，室温反应 30 min， 间隔 10 min 晃动反应管，避免磁珠沉淀，使磁珠与细胞充分反应，防止出现气泡。磁珠分离器分离 8 min， 去除未与磁珠结合的细胞。将结合了靶细胞的免疫磁珠用1mL磁珠分选缓冲液洗5次。37℃、5% CO 孵箱培养 48 h，使细胞与磁珠分离，得到较纯的 HFSCs。 1.4 检测指标 1.4.1 细胞活性检测 将纯化前后细胞悬液与0.4%苔盼蓝溶液按1：1体积比混合后，滴入细胞计数板，于倒置显微镜下观察。每种细胞各采用3份标本，每份标本随机于40倍显微镜下取3个视野，镜下观察不着色、发亮的为活细胞，着色、胞体膨大者为死细胞。分别计数未染色细胞数及细胞总数，计算未染色细胞占细胞总数的百分比。 1.4.2 细胞免疫荧光检测 分别于纯化前后取5 uL细胞悬液，于荧光显微镜下观察 CD200 表达情况。 1.4.3 HFSCs 纯度及回收率分析 取 CD200 孵育后行磁珠分选前后的 BCs 进行实验，以 PBS室温孵育30 min 的 BCs 为对照。各取5×105个细胞，以 PBS缓冲液清洗2次，离心半径12 cm， 1 500 r/min 离心5 min，去上清后加 PBS 缓冲液待上机。上机：激光管预热30 min 后用荧光微球调整仪器，使各放大器接收的信号的信头变换器(header convertor， HCV)值<2%，以对照管作为空白标定，记录标本的 CD200阳性细胞百分率。流式数据采用Cellquest pro 分析。纯度=阳性细胞数/细胞总数×100%；回收率=(纯化后细胞总数×纯化后阳性细胞百分比)/(纯化前细胞总数×纯化前阳性细胞百分比)×100%。 1.5 统计方法 采用 SPSS13.0统计软件包进行分析。数据以均数标准差表示，组间比较采用配对t检验，P值<0.05为有统计学意义。 2 结果 2.1 细胞培养观察 体视显微镜下见形态完好且处于生长期的毛囊(图1a)，培养第2天有细胞爬出，最初细胞在其周围聚集，并有分层现象，随后生长逐渐增快，向外伸展成片。约第6天细胞融合达80%(图1b)。细胞呈圆形，折光性强，表现为铺路石样；细胞大小一致，核大而明显，多偏居于细胞一侧。细胞间连接紧密，分层明显，此后增殖的细胞皆表现相同形态。消化后可见获得的 BCs并不均匀，为多种细胞混合(图1c)。K19检测结果显示，阳性细胞呈集落分布于细胞之间，胞浆内含大量棕色颗粒，符合BCs特性(图1d)。 2.2 细胞活性 纯化前细胞活力为95.0%±0.6%，纯化后为94.2%±1.0%。磁珠分选前后，细胞活性差异无统计学意义(P>0.05)。 2.3 细胞免疫荧光检测 荧光显微镜观察纯化前后细胞，可见蓝光激发细胞发出的绿色荧光，纯化前细胞基本呈单个分散状态，阳性细胞较少(图2a、b)；纯化后可见同一视野获得大量阳性细胞，并可观察到周围有许多小的黑色磁珠(图2c、d)。 2.4 HFSCs 纯度及回收率 结果显示，纯化前 CD200 阳性细胞的纯度为8.31%(图3a)，纯化后 CD200 阳性细胞纯度为82.31%(图3b)，对照为1.63%(图3c)。细胞纯化后， 3a 3b 图1 细胞培养观察 获得的含 Bulge 区毛囊(体视显微镜×40) 培养6d融合细胞(相差显微镜×100) C 消化后获得的混杂细胞(相差显微镜×100) 细胞K19组织化学染色表达阳性(相差显微镜×200) 图2 荧光显微镜下行纯化前后细胞免疫荧光检查(×200)纯化前HFSCs ⑥纯化前FITC标记CD200阳性细胞 纯化后HFSCs 纯化后FITC 标记 CD200阳性细胞 图3 CD200 阳性细胞纯度a纯化前创纯化后 C对照 Fig.l Observation of cultured cells The hair follicles with the bulge region (Style microscope×40)))D1The BCs started to pile up and led toformation of domes in 6 days (arrow) (Phase contrast microscope×100) @ Cells were collected by digestion (Phase contrast microscope × 100)K19 immunohistochemical staining of bulge area (arrow) in vivo (Phase contrast microscope ×200) Fig.2 The cells in pre- and post-purificationgroups were compared by immunofluorescence staining under fluorescence microscope (×200) HFSCs before purification CD200+ cellsbefore purification， labelled withCD200-FITC C HFSCs after purification @ CD200* cells after purification， labelled with CD200-FITC Fig.3 Per-centage of CD200+ cells Before purification After purification C Negative control 3 讨论 在毛发生长期，毛乳头细胞及相应角质形成细胞在毛囊上皮细胞调节下快速生长，使人们认为毛乳头是毛囊细胞分裂及生长的起始部位，同时推测 HFSCs是否存在其中 ]。Cotsarelis 等[6-7]通过3H-TdR 等一系列标记细胞实验提出，毛囊隆突部可能是干细胞贮存处的假设。Rochat等[8]通过鼠触须分段培养实验发现，隆突部是 HFSCs 的贮存处。Oshima 等[9]通过转基因鼠证实每个毛发周期中毛母质细胞是隆突部HFSCs 来源的，此后不断有研究证实 HFSCs 定位于隆突部[8-13]。同时显微解剖、组织切片以及皮片异种移植模型研究发现，鼠毛囊隆突部为其外根鞘一系列不连 续隆起，而人毛囊隆突部比较精细，大致位于其外根鞘最外层靠近立毛肌插入点处[14]，也确定了 HFSCs 在毛囊上的实际位置。有学者开始培养外根鞘细胞，试图获得 HFSCs8I。 Kurata 等[15]从志愿者头皮拔出毛囊，经胰酶消化后，利用胶原包被法培养外根鞘细胞获得成功。以后很多外根鞘细胞培养方法被提出，到目前为止，技术较成熟，应用最广的是显微分离培养法。但获得的外根鞘细胞中 HFSCs 数量十分有限。 临床应用干细胞治疗疾病首先要解决干细胞纯化培养问题，因此，寻找特异的干细胞标记物对干细胞分离培养尤为重要。HFSCs 标记物一直是研究的热点，相继提出许多标记，其中K19、K15和β整合素被普遍肯定[16-17]。然而这些标记物多数在细胞内表达，可为培养获得细胞提供鉴定依据，却无法为分选纯化提 供帮助。1996年问世的激光俘获显微解剖技术为准确获得 HFSCs 表面标记提供了可能，基本过程为在显微镜下放置一块着色的标准组织切片，观察受检细胞，利用一操纵杆围绕影像推动，当选中目标物时，可轻松地从组织中转移出期望获得的形态完整的纯细胞[18]。Ohyama 等[10]采用该技术精确获得人BSc，并通过芯片分析，得出人源干细胞符合 CD200CD24lo-CD34ICD71ICD146lo的结论，在 HFSCs 特异性标记确定和纯化分选获得大量高浓度 HFSCs上实现了重要突破。 我们的实验联用显微分离培养与免疫磁珠法，分离纯化人HFSCs。由于显微解剖法可首先从解剖学角度获得 HFSCs 富集部位，同时结合免疫磁珠法选择CD200阳性表达细胞，最终获得 HFSCs。较传统方法或免疫磁珠两步法有操作简便、经济，可获得大量干细胞的特点。我们的体会：①获得毛囊外根鞘细胞时调整消化方法为37℃消化2h，较以往4℃消化12 h，缩短了消化时间，避免干细胞损伤；②消化后从皮肤较为疏松的脂肪层方向拉出毛囊，较传统从表皮方向挤出毛囊，减少了因通过较致密真皮和表皮时损失的外根鞘细胞；③胰酶消化第1次培养出的外根鞘细胞前，先用 PBS清洗培养皿2次，保证消化效果，缩短了消化时间；④培养的外根鞘细胞可通过 K19 鉴定，利用 CD200阳性表达这一特点，一次性阳性选择毛囊干细胞；较磁珠两步法定位更加精确，节约成本；⑤显微解剖法与磁珠分选法对毛囊干细胞活性影响不大，所获得细胞的活性超过95%；⑥分选后毛囊干细胞培养48h可脱去磁珠，继续培养，发现其具有高速增殖、可多向分化等明显的干细胞特征。 总之，我们的实验联用两种方法获得 HFSCs，并采用流式细胞术鉴定纯化前后的纯度及回收率，为其大量纯化及后续研究提供了新的备选技术路线。该方法操作简便，单次操作分离细胞数量大且纯度较高，能与细胞培养、流式细胞术、荧光显微镜等分子生物学技术兼容。 ( 4 参考文献 ) ( 1 P aus R ， F o itzik K. 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