玻璃微珠法提取葡萄球菌基因组DNA的研究

Modern Food Science and Technology现代食品科技2010，Vol.26， No.2 现代食品科技2010，Vol.26，No.2Modern Food Science and Technology 玻璃微珠法提取葡萄球菌基菌组 DNA 的研究 赵文怡，高强，谯娜娜，张健，刘发保 (天津科技大学生物工程学院，工业微生物教育部重点实验室，天津300457) 摘要：作为革兰氏阳性细菌，葡萄球菌的细胞壁非常坚固，为提取其 DNA 造成很大困难。本实验比较了不同方法破除金黄色葡萄球菌细胞壁的结果，确定了玻璃微珠法破除其细胞壁具有简单有效快速廉价等优点，提取得到的基因组可用于 PCR实验，此方法扩展到人葡萄球菌和耳葡萄球菌能够达到同样的提取效果。 关键词：葡萄球菌；基因组DNA； 玻璃微珠； PCR 文章篇号：1673-9078(2010)2-154-156 Extraction of Staphylococcal Genome DNA using Glass-beads Method ZHAO Wen-yi， GAO Qiang， QIAO Na-na， ZHANG Jian， LIU Fa-bao (Key Laboratory of Industrial Microbiology， Ministry Education； College of Biotechnology， Tianjin University of Science &Technology， Tianjin 300457， China) Abstract： The cell walls of Gram-positive Staphylococci are difficult to be broken in DNA extraction. In this paper， 3 different methods forextracting Staphylococcus aureus genome were compared. Results showed that the extraction protocol using glass beads was simple， quick andeffective to break staphylococcal cell wall， and the extracted staphylococcal genome was eligible for PCR. This method was also suitable for breakingthe cell walls of S.hominis and S.auricularis. 葡萄球菌属 (Staphylococci)是一类革兰氏阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状故得名。其中多数为条件致病菌，个别菌株为肉类食品发酵用菌。作为最常见的化脓性球菌，葡萄球菌也是医院交叉感染的重要来源。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，其特征为起病急骤，呕吐剧烈伴失去及虚脱，这种疾病称为葡萄球菌食物中毒(staphylococcal food poisoning)"。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性食品卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒病例的33%，加拿大则更多，占到45%。我国每年发生的此类中毒事件也较多，其中金黄色葡萄球菌耐药菌株(MRSA) 高达90%以上2。为了解决这一问题，提取葡萄球菌基因组 DNA 是必要检测与处理手段之一。然而，由于葡萄球菌细胞壁坚厚，常规的蛋清溶菌酶对其没有明显的溶壁作用，而具有良好溶壁效果 ( 收稿日期：20 0 9-10-09 ) ( 基金项目：天津市应用基础及前沿技术研究计划(08JCZDJC15100) ) ( 作者简介：赵赵怡(1983-)，女，硕士研究生，研究方向：分子生物学 ) ( 通讯作者：高强(1965-)，男，教授，主要研究方向：工业与食品微生物的分子生物学 ) 的溶葡萄球菌素价格昂贵，难以普遍应用。本文通过实验对比，确定了利用玻璃微珠简单有效提取葡萄球菌基因组 DNA 的方法。 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验菌株与培养基 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)SA113 和耳葡萄球菌(S.auricularis)由德国图宾根大学 FriedrichGoetz 教授赠送，人葡萄球菌(S.hominis) 为本实验室保藏菌种。LB培养液(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。 1.1.2主要试剂 玻璃微珠：：河北省永清县兴华玻璃微珠有限公司；溶葡萄球菌素(lysostaphin)：德国 Genmedics GmbH公司赠送；蛋清溶菌酶(lysozyme)、Taq DNA聚合酶、RNaseA、EDTA、SDS、1kb DNALadder 和 DNA MarkerI：天根生化科技(北京)有限公司； NaCl、NaAc、CTAB、无水乙醇、酚/氯仿/异戊醇等均为国产分析纯，PCR扩增引物合成：北京三博远志生物有限责任公司。 1.1.3 主要仪器 QL-901型漩涡振荡器和 GKL-150型金属恒温浴： 江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司；琼脂糖凝胶电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司；凝胶成像分析系统：美国 Bio-Rad 公司； PCR合成仪：德国EppendorfGmbH公司； TG16G型离心机：湖南凯达科学仪器有限公司。 1.22方法 1.2.1 葡萄球菌基因组提取 将金黄色葡萄球菌 SA113菌株接种于5 mL LB培养液中，37℃振荡培养过夜，次日取1.5 mL 菌液以12000 r/min 室温离心 1 min收集菌体，并用如下三种方法破壁并提取基因组 DNA2， 再从中选择合适的方法提取人葡萄球菌和耳葡萄球菌的基因组 DNA。 方法1：溶菌酶法。菌体沉淀重悬于补加叮20mg/mL 溶菌酶的 100 pL 溶液 Ⅰ(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl， 10 mM EDTA， pH 8.0)， 37℃水浴1.5 h 后加入100 pL溶液Ⅱ(0.2mMNaOH， 1%SDS)， 快速颠倒离心管，待混合物变得清亮粘稠后置冰上放置 5min， 最后加入150 uL溶液Ⅲ (5M KAc 60 mL， 冰乙酸 11.5 mL， 28.5mL)，温和振荡使溶液充分混匀，混合物变成絮状沉淀后置冰上 30 min， 再于8000 r/min室温离心10 min，取上清加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，8000 r/min 室温离心10 min， 取上层水相，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)， 8000 r/min 室温离心10 min， 取上层水相，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后-20℃冷冻1h 以上，12000 r/min 室温离心10 min，弃上清，沉淀于-20℃保存备用3.4。 方法2：溶葡萄球菌素法。菌体沉淀重悬于 100puL溶液Ⅰ，依据不同的葡萄球菌种类加入0.5 mg/mL 溶葡萄球菌素 10~20pL，后续实验步骤同方法1。 方法3：玻璃微珠法。菌体沉淀重悬于 100 pL溶液Ⅰ，加入 40 uL 玻璃微珠，在漩涡振荡器上振荡2~5min(每振荡1 min 后冰浴 10 s)后加入 100 pL 溶液Ⅱ，后续实验步骤同方法1。 1.2.22有葡萄球菌基因组 DNA提取物的电泳检测 将提取的葡萄球菌基因组 DNA 沉淀溶于 50pL的 TE缓冲液(10mM Tris-HCl， 1 mM EDTA、pH 8.0)中，取3pL用于1%的琼脂糖凝胶电泳初步检测基因组DNA的提取效果。 1.2.33PCR扩增验证 根据KEGG公布的 S.aureus 的甲酸脱氢酶基因 fdh的序列，设计一对引物 (GF： 5'-AAGGATCC ATGTCAAACGGTGCCG-3'， GB：5'-CGGAATTCAGTGAACA CATATGTGCG-3')检测提取的 S.aureus 113 基因组DNA的模板质量， PCR 反应条件为：94℃预变性5min，循环参数为94℃ 45 s， 45℃ 45 s，70℃70s，30个循环后72℃延伸 10 min； PCR反应体积为25 uL，上下游引物1uL，模板1uL，双蒸水9.5 uL， Taq PCRMasterMix12.5 uL。用量参照已知葡萄球菌的脂肪酶保守序列，设计一对兼并引物(Geh-F：5'-GT(A/T) GA (T/C)TATGGTGC(A/T/G)GC(A/C)C-3'， Geh-B： 5'-T(G/C/T)AC(T/C) TGCCA(G/T/A)A(C/T)ACC(T/C)TT-3') 来检测人葡萄球菌和耳葡萄球菌的基因组 DNA 模版质量，PCR 程序同上。取10 pL PCR 反应产物在1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。 2 结果与分析 2.1 三种方法的提取结果比较 三种提取方法所得基因组产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1。由图1可知，用溶葡萄球菌素的方法提取葡萄球菌基因组的效果最好，但该酶制剂价格昂贵；玻璃微珠破壁法也可以取得比较好基因组 DNA的效果，提取量足够用于实验研究；溶菌酶法的基因组 DNA 提取量在这三种方法中是最少的。 图1三种方法所提取基因组的对比 Fig.1 The comparison of genome DNA extracted fromstaphylococcal by different extraction methods 注：泳道1为1kb DNALadder； 泳道2~4分别为方法1、2 和3的基因组提取物，其中玻璃微珠法的震荡时间为 3 min。 2.2 玻璃微珠法震荡时间不同的结果对比 玻璃微珠法是采用物理方法进行葡萄球菌细胞壁的破壁，图2是采用玻璃微珠法破壁的电泳图。 由图2可见， 3 min 振荡已经能够提取到清晰条带，但是振荡时间为 5 min 时，提取的 S.aureus 基因组的效果最佳。 图2用玻璃微珠法提取 S. aureus 基因组的震荡时间比较 Fig.2 The effect of shaking time with glass beads on extractingS.aureus genome DNA 注：泳道1为1kb DNA Ladder； 泳道2~5分别为震荡5、4、3、2 min后的基因组提取物 2.3 PCR扩增结果 图3所示溶葡萄球菌素法和玻璃微珠法都能取得良好的效果，溶菌酶法效果最差，未能获得 PCR 产物。 2 3 4 5 图3 PCR产物 Fig.3 Electropherogram of PCR product 注：泳道1为1kb DNA Ladder；泳道2~4分别为方法1~3提取物为模板的 PCR 扩增产物；泳道5为阴性对照。 2.4 玻璃微珠破壁提取基因组的方法推厂广 将该方法推广到耳葡萄球菌和人葡萄球菌也取得了很好的结果。图4为其 DNA 电泳图，图5为PCR产物的电泳图。 图4玻璃微珠法提取人葡萄球菌和耳葡萄球菌基因组 Fig.4 Electropherogram of genome DNA extracted fromS.hominis and S.auricularis using glass beads 注：泳道1为1kb DNA Ladder；泳道2为耳葡萄球菌基因组；泳道3为人葡萄球菌基因组。加入玻璃微珠震荡时间均为3 min 图5人葡萄球菌和耳葡萄球菌的 PCR 产物 Fig.5 Electropherogram of PCR products with S.hominis andS.auricularis genome templates 注：泳道1为 DNA Marker Ⅲ，泳道2为人葡萄球菌的 PCR产物，泳道3为耳葡萄球菌的 PCR 产物 3 讨论 本实验首先以金黄色葡萄球菌为出发实验菌种，比较了溶菌酶法、溶葡萄球菌素法和玻璃微珠法破壁提取基因组 DNA 的效果。我们发现，溶菌酶法需用时间最长，且效率最低；溶葡萄球菌素法效率最高，但溶葡萄球菌素价格非常昂贵，难以全面推广应用；而玻璃微珠法为物理方法，可以有效破坏金黄色葡萄球菌的细胞壁，所提取的基因组 DNA 可以作为模板用于PCR试验。但实验中需要注意破壁时间为本实验的关键，破壁时间为 3 min 时所获得的基因组 DNA足以满足常规 PCR试验。 在本实验中，玻璃微珠破壁提取金黄色葡萄球菌基因组 DNA的方法也推广到了其他葡萄球菌，如耳(葡萄球菌和人葡萄球菌，均取得了较好的效果，所提取的基因组质量可以完全满足 PCR 实验的需要。由于玻璃微珠法破壁所用材料价格低廉、用时较短、提取出的基因组可用于 PCR 实验，因而具有良好的提取效果，可以推广使用。 ( 参考文献 ) ( [ 1 ] 张凤笑，石磊.PCR技术在金黄色葡萄球菌中的研究进展[] 现代食品科技，2008， 24(10)：1042-1047 ) ( [2] 黄剑屏，黄薇，唐晓旻，蔡炯，李佳.金黄色葡萄球菌与奇异变 形杆菌混合感染引起的食源性疾病[].中国卫生检验杂志， 2006，16(11)：1376-1377 ) ( (下转第202页) ) 虽然此次三批样品中金黄色葡萄球菌的检出率很低，但仍然存在着潜在的危险性，食用污染蛋会对人的身体造成很大伤害。试验表明，三种致病微生物中大肠杆菌对鸡蛋造成的污染最为严重，而大肠杆菌是粪便指示菌，因此在污染大肠杆菌的同时，会有大量其他的微生物污染了鸡蛋。 4 结论 通过试验可以看出，北京地区农贸市场所售鸡蛋不同程度的受到微生物污染，存在一定的安全风险，但是普通大众并没有意识到这些问题，日常食用的鸡蛋主要还是来自农贸市场的普通鸡蛋，而部分经过灭菌和保鲜处理的鸡蛋价格较普通鸡蛋价格要高很多。因此怎样以较低成本对鸡蛋进行灭菌处理，实现“洁蛋”上市，让广大群众以普通蛋价格吃上安全放心的食品蛋，是摆在科研工作者面前的又一难题，需要广大学者进行更加深入的研究。 ( 参考文献 ) ( [1] 李晴云，杜华锐，蒋小松，等.鸡蛋微生物测定与分析[.四川 畜牧兽医，2003，30(5)：22-23 ) (上接第156页) ( [3] FM 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