组织微阵列(组织芯片) 在肿瘤研究中的应用

肿瘤防治研究2003年第30卷第6期915. 组织微阵列(组织芯片)在肿瘤研究中的应用 阎晓初，段光杰 关键词：组织微阵列；肿瘤；应用 中图分类号：R730.2 文献标识码：A 文章编号：1000-8578(2003)06-0519-03 0 引言 随着人类基因组计划的完成并进入后基因组时代，基因研究的重点已从结构转向功能。由于基因芯片(gengchi p)的广泛应用，基因表达谱和基因变异谱的研究会得出越来越多的与肿瘤分析相关的侯选标志基因。这些基因组学的早期发现，在临床诊断和治疗的实际应用之前需要进行进一步测试，需要在更多的临床肿瘤标本中通过原位杂交和免疫组织化学染色的验证，以筛选与某种肿瘤诊断、预后及治疗相关的基因2。而目前传统的组织切片处理方法由于在一个蜡块内只能包埋一个组织标本，只能切出含有一份组织样本的切片，不利于快速高效的进行大量指标的筛选工作。组织微阵列(tissuemicroarray，TMA 又称组织芯片(tissuechi p)就是在此背景下发展起来的3，它能高效地对大量组织样本进行研究，高通量筛选侯选标志基因或其表达产物。本文就 TMA的制作及应用作一介绍。 1 组织微阵列的概念及制作 TMA是1998年由 Kononen 等3]在 cDNA 微阵列的基础上发明的。它是将成百上千的小块组织高密度地固定排列在一张玻片上，然后用其进行免疫组化、原位杂交或其它分子病理检测技术操作，以研究、比较目的基因或其表达产物在不同组织、不同肿瘤以及肿瘤不同发展阶段之间的差异表达情况。 TMA的制备包括：a.制作模具蜡块，大小为45mm X20mm， 在模具蜡块上打出间距为0.1 mm，直径为0.6 mm的小孔，每个小孔以坐标准确定位。b.样本蜡块根据HE染色观察，选定并分别在HE切片和相应石蜡组织块上标记取样组织的位点，用内径0.6mm的不锈钢针进行穿刺，深度2~3mm，将其固定于模具蜡块的小孔内。c.将模具蜡块以 ( 收稿日期：2002-05-13：修回日期：2003-08-16 ) ( 作者单位：400038重庆，第三军医大学西南医院病理学研究所 ) 4um厚度切片，敷贴于载玻片或尼龙膜等固相载体上，就制成了组织微阵列，即可进行免疫组化染色和原位杂交。 2 组织微阵列在肿瘤研究中的应用 TMA 可用于基因表达检测、优化探针和抗体、构建组织库、药物筛选及疾病诊断等方面4]。与基因芯片相比，TMA 除可使用DNA或RNA 分子杂交如荧光原位杂交(fluorescenceinsituh ybridiza-tion，FISH)技术外，最为突出的是它将基因、蛋白水平的研究与组织形态学相结合，能在细胞水平定位和蛋白水平检测，因此在肿瘤研究中具有极大的潜力和价值。 TMA可被用来鉴定 cDNA芯片筛选出的众多侯选标志基因及其表达产物。Barlund 等先在含有4209个克隆的cDNA 芯片上对乳腺癌组织中核蛋白S6激酶基因(S6K)进行杂交，发现乳腺癌细胞株MCF7 的 S6K 比正常乳腺表达增高，再应用FISH 技术在 TMA上检测668例原发性乳腺癌S6K 和 HER-2基因的表达，显示 S6K 表达水平与乳腺癌恶性程度正相关，S6K 和 HER-2基因同时表达的患者预后差。说明联合应用cDNA 芯片和组织芯片技术可以快速、高效地获取信息，大大加速了对新发现的侯选标志基因临床意义的鉴定过程。类似的研究在前列腺癌和肾癌中也有报道：Bubendorf等6利用人类前列腺癌细胞系在由5148个基因构成的 cDNA芯片中，筛选编编码胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)和27KD 热休克蛋白(HSP27)的基因，然后在由26例良性前列腺增生，208例原发性前列腺癌和30例有激素抗性的局部复发癌样本制作的TMA上应用免疫组化验证了其表达情况。Moch 等用基因芯片技术检测肾癌细胞系CRL-1933中5184 种cDNA的表达，发现89种差异表达的基因中有一条编码波形蛋白。然后采用免疫组化方法在含532例肾细胞癌标本的 TMA 上检测波形蛋白的表达，发现51%的透明细胞癌，61% 的乳头状癌呈阳性，而仅在4%的嫌色细胞癌和12%的嗜酸细胞癌出现阳性表达，且波形蛋白表达与患者不良预后密切相关。 运用 TMA 可将某些分子改变与肿瘤发生发展过程的特定时期联系起来，有助于对肿瘤演进的研究。有作者16，8]利用TMA 研究发现雄激素受体(AR)基因的扩增和IGFBP2 蛋白的过表达在激素治疗抵抗性的前列腺癌中很常见，而在原发性癌非常少见，从而提示二者可能在前列腺癌激素治疗失败中起一定作用。Bubendorf 及 Bowen 等制作了前列腺癌“演进组织微阵列”(ProgressionTMA)，在一张 TMA上包括了前列腺癌发生发展过程的各个阶段，如正常前列腺组织、良性前列腺增生、前列腺上皮内瘤变、临床局限性癌、远处转移及激素治疗抵抗性癌。并在包含517例各期样本的 TMA上用免疫组化检测了染色体8p21区的一个同源盒基因NKX3.1 的表达，发现5%的良性前列腺增生、20%的高度上皮内瘤变、6%的 Tla/b期、22%的 T3/4期34%的激素抵抗性癌和79%的转移癌中存在NKX 3.1完全失表达。结果不仅验证了 NKX 3.1是抑癌基因，并提示其失表达与前列腺癌激素治疗抵抗性和侵袭转移密切相关。运用同样方法，Richter 等110检测了来自1842例膀胱癌患者的2317份样本组织CyclinE基因的表达。FISH 技术发现CyclinE 扩增和肿瘤的分期、分级有关。免疫组化显示 CyclinE 在1873例样本肿瘤中表达强度从pTa 期(22.2%)到pT1期(45.5%)明显增强，但在pT2-4期表达减弱，提示 CyclinE 过表达是膀胱癌早期浸润阶段的一个特点。 由大量有临床随访资料的肿瘤样本组成的“预后组织微阵列”(PrognosisTMA )可用于回顾性研究，分析侯选基因和肿瘤标志物与患者预后的关系。Simon 等1]运用 FISH 技术，在2317例胱癌的TMA上分析染色体3p25及8p11~p12区类风湿性关节炎因子(RAF1)和成纤维细胞生长因子受体(FGFR1)基因的表达，发现 RAF1 和 FGFR1 的扩增与缺失均与肿瘤组织分级和不良预后密切相关。Hoos等[12]选取临床参数(直径、分级、浸润深度、切除范围)完全一样的47例高度恶性软组织肉瘤(19例无瘤存活，28例死亡)，采用每块原发瘤取3个样本的方法制作了一张TMA， 应用免疫组化检测发现，死亡组Kr67指数显著高于存活组，Ki-67 是有意义的预后指标。上述研究提示运用预预TMA 能高通量筛选各种侯选基因，并能快速将其表达产物与不良预后联系起来，这对于临床后续治疗将有重要的指导意义。 另外，Schraml等3]等首次构建了一个397例含有17种不同类型肿瘤组织的 TMA，采用FISH技术检测了 erbB-2，c-myc 和 CyclinD11.三个基因的扩增情况。这种“多肿瘤组织微阵列”(multi-tumorTMA)筛选技术提供了一个更为强大的 TMA分析范例，因为它不仅可以在一个特定肿瘤类型内鉴定基因表达，还能广泛筛选不同肿瘤之间可能存在的分子改变，这对于筛选、验证基因组学上数量众多的侯选基因表达有积极的现实意义。Bubendorf等2制作了目前最大的多肿瘤TMA，在10个模具蜡块中包含了130种肿瘤的4788 例样本，包括354例正常组织和709例转移癌。这些TMA 将被用来分析各种新发现的侯选基因在正常组织和肿瘤组织中的表达。 3 优点和存在的问题 3.1 优点 TMA具有其它微阵列技术的优点，它容纳的信息量大，可以在短时间内高通量、快速、平行检测大批量组织样本中的多个实验指标，大大提高了实验效率。而且在一个 TMA 上进行多样本的比较，可以排除一系列复杂因素导致的组内或批间差异，使一次性多样本比较分析的准确性大为提高。其次，TMA 上所取组织样本定位准确，无效组织的数量大大减少；而微小的样本组织(直径0.6 mm)基本不会毁坏原始蜡块，有利于病理档案的保存。此外，阵列蜡块的制作和数据分析已能实现自动化[i4]，在制作过程中可人为控制各样本组织的排列位置，便于设置各种对照。TMA对于病种多、存档量大的病理科室建立各种肿瘤性、非肿瘤性疾病的组织库亦是一种非常有用的方法。 3.2 存在的问题 由于肿瘤细胞的的质性，TMA上直径0.6mm的样本能否代表原组织标本尚有争议。在这方面有不少学者已证实应用TMA 进行原位杂交和免疫组化染色所得结果与传统方法完全一致[2-3，13-16]；也有学者提出，采用增大样本组织(如直径1.5 mm或3mm)或在一个蜡块不同区域挖取2个或更多组织样本的方法以提高其代表性2，12]，但何为最佳方法还有待进一步探讨。TMA的制作仪器及操作系统目前的价格是很昂贵的，还不能为大部分使用者所能承受。样本与载体结合的牢固性问题也需改进，这些有待在实际应用中加以解决。 4 前景与展望 TMA 作为一项新兴的生物学研究技术，它的应用实现了对细胞、蛋白、核酸等生物组分的准确、快速、大信息量的检测，使实验效率大为提高，肿瘤研 究的信息更为丰富。国内外许多实验室、专业公司已在大力开发研制与此相关的技术，目前已有了组织芯片仪和生物芯片信号处理系统，使TMA的批量制作和自动分析成为可能o。随着 TMA 制作技术的提高，成千上万个肿瘤样本排布在为数不多的微阵列上，就可以为众多侯选基因的表达产物进行组织学定位，为许多肿瘤诊断和预后的分子标志提供批量检测的机会。我们有理由相信，在生命科学飞速发展的后基因组时代，TMA 将在肿瘤研究中发挥越来越大的作用。 ( 参考文献： ) ( [1] MedlinJ.Arra yofho p e for genetechnolo g y [].EnvironHealthPerspect，2001，109( 1 )：34-37. ) ( [2]BubendorfL，NocitoA，MochH，etal.Tissuemicroarra y(TMA) technology：miniaturized pathologyarchivesforhi gh-throu ghputinsitustudies[J].JPathol，2001，195 (1)：72-79. ) ( [3]KononenJ，BubendorfL，KallioniemiOP，etal.Tissuemicroarraysforhi ghthrou ghputmolecular p rofilingoftumors p ecimen[J].Natmed，1998，4 (7) ： 844-847. ) ( [4]MochH，KallioniemiOP，SauterG，etal.Tissuemicroarra ys： whatwillthe y brin gtomolecularandanatomic pathology?[J]. AdvAnatPathol，2001，8 (1)：14-20. ) ( [5]BarlundM，ForozanF，ChenY，etal.Detectin gactivationofribo - somal proteinS6kinase b ycom plementaryDNAandtissuemicroar -raysanal y sis[J].JNatlCancerInst，2000，92 (15) ：1252- 1 259. ) ( [6]BubendorfL，KolmerM，KoivistoP，etal.Hormonethera pyfail-ureinhuman prostatecancer：anal y sisb ycom plementar yDNAand tissuemicroarra ys[J].JNatlCancerInst，1999，91 (20)：1758-1764. ) ( [7]MochH，SchramlP，MirlacherP，etal.Hi gh-throu ghputtissue microarrayanal y sistoevaluate genesuncoveredb ycDNAmicroar -rayscreenin ginrenalcellcarcinoma[J].AmJPathol，1999，154 ) (上接第517页) 发生的有差别，这可能与个体免疫功能及抵抗力有关。发生部位以单发者生存率较多发者好，统计上有显著差异，这与单发灶易治疗，毒副反应轻有关。有无咯血的临床症状其2年生存率差别亦大，与可能肿瘤侵向范围广有关，故预后亦差。单纯出现肺转移者治疗后2年生存率较合并局部复发的差异不大，但与合并骨转移、肝转移、广泛转移者差异大，这与病程发展、治疗易难有关。 ( (4) ： 981-986. ) ( [8]BubendorfL，KononenJ，KoivistoP，etal.Surve yof geneam pli- ficationsdurin g prostatecancer progressionb y hi g h-throu ghputflu - orescenceinsituh vbridizationontissuemicroarra ys[J].CancerRes，1999，59(4) ： 803-806. ) ( [9]BowenC，BubendorfL，VoellerHJ，etal.LossofNKX3.1ex pressioninhuman prostatecancercorrelateswithtumor progression [J].CancerRes，2000，60 (21) ： 6111-6115. ) ( [10]RichterJ，KononenJ，BrudererJ，etal.Hi gh-throughputtissuemicroarrayanal ysisofc yclinE g eneam plificationandoverex p r essioninurinar ybladdercancer[J].AmJPathol，2000，157 (3) ： 787- 794. ) ( [11]SimonR，Wa gnerU，Fi janU，etal.Hi gh-throu ghputtissuem i - croarrayanal ysiso f 3 p25(RAF1) and8 p12(FGFR1) c o pynumber alterationsinurinar y bladdercancer[].CancerRes，2001，61 (11) ： 4514-4519. ) ( [ 1 2]HoosA，Sto j adinovicA，MastoridesS，etal.Hi ghKi-67 prolifer- ativeindex pr edictsdiseases p e cificsurvi v alin patientswithhi gh- risksofttissuesarcoma[J].Cancer，2001，92 (4)：869-874. ) ( [13]SchramlP，KononenJ，BubendorfL，etal.Tissuemicroarra ysforgeneam plificationsurve ysinman y differenttumortt y pes[J].ClinCancerRes，1999，5 (8)：1966-1975. ) ( [14]KallioniemiOP，Wa gnerU，SauterG，etal.Tissuemicroarra y technologyforhi g h-throughputmolrcular pr o filingofcancer[J].HumMolGenel，2001，：10 (7) ： 657-662. ) ( [15]MarkA，RubinMD，NeilR，etal.E -cadherinex p ressionin prostatecancer：abroadsurve yusin ghi gh-densitytissuemicroarra y technology[].Human.Pathol，2001，32 (7)：690-697. ) ( [16]RobertL，CampLA，Cha r etteDL，etal.Validationoftissuemi croarraytechnolo g yinbreastcarcinoma[J].LabInvest，2000，80 (12) ： 1943-1949. ) ( [17]Manle yS，MucciNR，De -MarzoAM，etal.Relationaldatabase structuretomana g e hi gh-densitytissuemicroarra ydataandimagesfor pathologystudiesfocusin gonclinicaloutcome：the prostate s pecializedpro gramofresearchexcellencemodel[J].AmJPathol，2001，159 (3)：837-843. ) ( (安 凤校对) ) 鼻咽癌肺转移治疗失败原因本组仍是肺内复发或未控和远处转移，治疗方法从本组统计得出单纯放疗、放疗+化疗2年生存率有明显差异，毒副反应可以耐受，可能与鼻咽癌肺转移癌对放射线敏感，对化疗药物敏感有关。表明对鼻咽癌肺转移病例应积收治，并采取综合治疗的措施，能提高患者生存率及生活质量。 ( (刘红武校对) ) ◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. 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