化学药中特殊物质和基团检测方案

化学传感器CHEMICAL SENSORS第29卷第3期2009年9月Vol. 29， No.3Sept .2 0 0 9 化 学 传 感 器1429 卷 用于微量锌离子检测的荧光探针技术 潘 忠*，，黎 敏 (武汉理工大学物理系，湖北武汉430070) 摘 要：该文对近年来用于微量锌离子检测的荧光探针按荧光检测技术的需求，根据锌荧光探针基团的不同，对其进行了细致的分类；在此基础上对不同基团探针的效率、光化学性质、工艺和局限性进行了对比和讨论，最后对微量锌检测技术的发展前景和新的研究点进行了展望。 关键词：传感器；荧光探针；Zn²；定量检测 Research development of fluorescent probe measurementof trace element zinc Pan Zhong， Li Min (Department of Physics， Wuhan University Of Technology，Wuhan 430070， China) Abstract： Zn’+ fluorescent probes were classified meticulously based on their fluorophore and recent advances influorescent probes in zinc measurement were summarized comprehensively ， Furthermore， the quantum efficiency，photochemical properties、typical technologies and limitations of various fluorophores were discussed in detail. Key words： sensor； fluorescent probe； zinc(Ⅱ)； quantitative detection 0引言 荧光探针法是利用荧光传感技术，通过测量微量元素离子的出现或浓度的改变所引起荧光强度、寿命、光谱等参数的变化量实现测量。巧妙设计的荧光探针能够将可测量的荧光参数与被测离子的浓度一一对应，可实现高精度的定量测量。因此荧光探针的优化设计是实现荧光法测量的关键问题之一。从20世纪70年代开始的微量元素研究，目前仍然面临着准确、快速、低成本测定的问题，其核心问题之一即难于获得高选择性的探针分子。为此世界范围的生化领域开展了大量的研究工作11。 锌是一种重要的人体必需的微量元素，广泛分布于人体的细胞和体液中。Zn²参与了很多生 ( 基金项目：湖北省自然科学基金(2008CDB112)资助项目 ) 物学过程，例如 DNA 合成、基因表达、微管的多聚化、基体免疫、酶催化等诸多方面，其重要性得到了广泛的认认。因此Zn²的检测，尤其是活体细胞和组织中锌的测定与荧光显微成像成为近年来生物化学家非常关注的领域。不同于其它过渡金属离子(如Fe、Mn²、Cu²)，由于最外层电子分布为3d4s，Zn不显现任何波谱或磁信号，因此常用的紫外光谱、圆二色谱、核磁共振、电子顺磁共振和穆斯保尔光谱仪等均不适用于Zn²的测定，而常用的分析方法中，荧光法用于测定Zn²*具有选择性好、灵敏度高、简便、快捷等优点。此前，已有数篇生化专业的文献对Zn²的阶段性发展作了综述12~3]，但其是按照荧光针针的发光机理和设计原理不同进行分类，侧重于性能优良的新型Zn²荧光探针的获取，对其应用于微量Zn²+检测 技术考虑较少。该文从Zn²荧光检测技术的需求出发，针对Zn²荧光法测量的关键问题——Zn²探针分子，分析、类比和总结了不同Zn²+荧光探针的特异性基团在Zn²含量检测中的效果和适用性，为利用荧光法高精度测量Zn²含量提供进一步研究的基础和参考。 1Zn²荧光探针 1.1 染料类荧光探针 染料类荧光探针以喹啉及其衍生物为主，常见类型包括氨基喹啉和羧基喹啉及其衍生物类。使用最广泛的类型是以8-氨基喹啉和8-羟基喹啉为基体，其中，几种具有代表性的探针分别是：TSQ，ZinquinA， QQB， Danquin 和 TAEA-IR-780 等。 TSQ(如图1所示)[4]是源于 1987年，最初用 于神经细胞中锌的荧光成像，是生物荧光技术发展史上的一个里程碑。TSQ 和Zn²结合后激发和发射波长分别位于 380 nm 和495nm，荧光强度增强100倍，但TSQ-Zn²络合物的结构和稳定常数(TSQ/Zn²+可能以1：1或2：1的形式络合)不确定，并且络合物的荧光强度在不同介质中变化较大，所以用 TSQ进行Zn²的定量分析有待进一步的研究。 为了提高 TSQ的水溶性和透膜性，Zalewski等在 TSQ的6位上引进了酯基，生成 Zinquin(如图2所示))。 Zinquin 能检测的 Zn²浓度范围在100 pmol/L~10 nmol/L之间， Zinquin 在酶的作用下水解生成羧酸根阴离子 ZinquinA (如图2所示)后可以长时间停留在细胞内，从而考察Zn²*在细胞生长规律中的作用，对细胞内Zn动力学进行研究，其激发和发射波长分别为 370 nm和490nm。 EtO，C 图 2分子结构2和分子结构 3 图1 分子结构1 Fig.1 structure of molecule l 同样是为了提高 TSQ 类荧光探针的水溶性，刘育等[6]将水溶性的β-环糊精引入到 TSQ分子的设计中，合成了化合物3(如图3所示)。该探针分子已经被用于巨噬细胞胞Zn²的荧光成像。 吴红梅等71设计合成了QQB(如图4所示)。该探针与Zn²*结合后荧光发射光谱由 405 nm 红移到 510 nm，且荧光强度增强，具有较高的检测灵敏度。 以上几种荧光探针的激发光都是紫外光，而紫外激发容易对生命细胞产生伤害，也会产生Zn²动力学活动的假象。在氨基喹啉的基础上，添 Fig.2structure of molecule 2.3 加一个1-二甲基胺基萘-5-磺酰，即可合成由可见光激发的荧光指示剂 Danquin(如图5所示)8。其激发和发射波长分别为395 nm 和465nm。 唐友云等I9以三菁菁近红外荧光染料IR-780为原料，合成了一种用于检测Zn²的近红外荧光探针 TAEA-IR-780 (如图6所示)。TAEA-IR-780 的和发和发射波长分别位于683nm 和 750 nm，其检测下限达1 nmol/L，其在活体细胞内的表现尚不明确。 1.2 助染剂类荧光探针 助染剂类荧光探针以吡啶衍生物为主。特别 图3 分子结构3 Fig.3structure of molecule 3 图5 分子结构5 Fig.5 structure of molecule 5 是 DPA(如图7所示)和具有良好水溶性和透膜性的 TPEN(如图8所示)。 DPA 的链状敞开式结构能快速与金属离子络合，保证检测的实时性，是一种常见的Zn²荧光探针。TPEN 是一种高选择性的过渡金属阳离子子合剂，和Zn²有很好的亲和性(解离常数K=2.60×10-16 mol/L)。·一些含DPA， TPEN 等剂合剂的Zn²+荧光探得得到了广泛的运用，比如：Zinpyr-1，ZnAF-1， ZnAF-2，Zinbo-5，[Co(bpy)2ODHIPJ*， DPA-Cy， DIPCY 等。 1.2.1 Zinpyr-x类 Zinpyr-x类荧光探针利用光诱导电子转移的 DPA 图7 分子结构7 Fig.7 structure of molecule 7 图4 分子结构4 Fig.4 structure of molecule 4 TAEA-IR-780 图6分子结构6 Fig.6structure of molecule 6 机理来检测 Zn’，Zinpyr-1(如图9所示)f10]是这类探针中的典型代表，与Zn**结合后，其荧光量子效率从0.39增加到0.87，激发和发射波长分别为500 nm 和530 nm。 Zinpyr-1的激发谱与488 nm的氩离子激光谱线完全重叠，这一性质有利于其在激光共聚焦显微扫描技术上的应用。 1.2.2 ZnAF-x 类 Tomoya Hirano 等把 DPA 引入5-或 6-氨基荧光素，合成了 ZnAF-1和ZnAF-2 (如图10所示)。其激发和发射波长分别为 492 nm和514nm，背景荧光量子效率仅为0.02，结合 Zn²后荧 图8 分子结构8 光强度分别增强17倍和51倍。但ZnAF-1和ZnAF-2都不适合于弱酸性条件下 Zn²+的检测。为此， 在ZnAF-x分子中引吸吸电子基F合成 图99分子结构9 Fig.9198structure of molecule 9 中性以及弱酸性条件下有更稳定的荧光。 此外，为解决该类探探用于Zn²定量检测问题，以苯并呋喃为荧光团，DPA 为受体，基于分子内共轭电荷转移原理设计而成了Zn2+荧光探针ZnAF-R1 和ZnAF-R2(如图11所示)[13]，ZnAF-R2的水溶性及荧光性质好，更适合生物体系中Zn²检测。随着Zn²的增加，ZnAF-R2 的最大激发波长从 365 nm 蓝移到335 nm， 且荧光强度比例(I335/1365)不断增大，测定该比值即可计算出Zn²的农度。 图 12分子结构12 图111分子结构11 Fig.122structure of molecule 12 Fig.111structure of molecule 11 6-ZnAF-2 ZnAF-2F 图 100 分子结构10 Fig.10I0structure of molecule 10 1.2.3 Zinbo-x类 Zinbo-x类荧光探针由具有高荧光特性的苯并恶唑和各种不同Zn²螯合团组合而成。比例计量型Zn²+荧光探针 Zinbo-5 (如图12所示)[141对Zn²有较强的亲和力(解离常数K：=2.2 nmol/L)与高选择性。Zinbo-5 在结合Zn²*前其激发和发射波长分别为337 nm 和407 nm，结合Zn²离子后其激发和发射波长分别分移至376 nm和443nm， 伴随着荧光量子效率增加5倍。随着 Zn²+浓度的增加，荧光强度比例 (Iaas/l376)增犬了30 倍。Zinbo-5 可以用来探测纤维细胞内Zn浓度的改变。 1.2.4 DNA参与键合与识别类 近十几年来，对小分子过渡金属配合物与大分子 DNA键合与识别机理的研究一直是国际上生物无机化学领域十分活跃的热点。张黔玲等115]合成多吡啶钴(Ⅲ)配合物[Co(bpy)20DHIP]3+(如图13所示)的研究显示，与Zn²配位形成的双核 图13分子结构13 Fig.13 structure of molecule 13 图14 分子结构14 Fig.14 structure of molecule 14 荧光探针，检测分辨率达到纳摩尔量级。 1.3 肽和蛋白类荧光探针 相对于那些小分子荧光探针，对于Zn²探针的另一研究焦点是基于肽和蛋白质的大分子的荧光探针。 1.3.1 肽荧光探针 1996年， Walkup 等设计出了一种以肽为Zn²配体的荧光探针ZNS1(结构如图17所示)[19]。其中，配体部分是 Cysz/Hisz， 荧光母体是丹磺酰 配合物[Co(bpy)z(ODHIP)Zn]*具有强的荧光，但配体 ODHIP 的两个-0H可以与很多金属离子配位形成双核配合物，因此该荧光探针对 Zn的选择性低。 1.2.5 三碳菁染料与 DPA 结合类 两种以 DPA 为受体合成的近红外Zn²+荧光探针 DPA-Cy(结构如图14所示)[16]。和 DIPCY(如图15所示)，分别以丙基取代的三碳菁染料和三碳菁染料为荧光团，都对Zn²有很高的亲和力。DPA-Cy 的激发和发射波长分别为730 nm 和780 nm， 结合Zn²后荧光量子效率增大20倍，该探针已经用于活体巨噬细胞中Zn+的检测。DIPCY 结合Zn²后，最大激发波长从 627 nm红移到671 nm，且随着Zn²浓度的增加，荧光强度(on/Icrn)增强5倍。但是还没有该探针的生化应用报道。 最近报道合成了5-5'-乙烯基-2，2-联吡啶衍生物16(如图16a~c所示)[l8]. a~c的激发和发射波长分别为407 nm 和 537 nm。c在生物体pH值环境中对Zn²有很好的选择性，是理想的Zn² 图15 分子结构15 Fig.15 structure of molecule 15 胺。ZNS1 的最大发射波长是560 nm，随着 Zn²浓度的增加，发射波长蓝移到475 nm，荧光强度呈线性增加。但由于分子中肽的存在，对任何金属引起的构型变化都很敏感；而且半胱氨酸(Cys)容易被氧化，所以不适合在一些含氧化剂的溶液中应用。 1.3.2 蛋白质类荧光探针 蛋白类荧光探针的合成比肽类的合成要困难许多。常见有两种类型的蛋白类荧光探针，一 /2 图 16 分子结构16 Fig.16Ss1tructure of molecule 16 种基于碳酸酐酶(CA)发展而来，另一种是基于绿荧光蛋白(GFP)f201发展起来的。 图17 分子结构17 Fig.17 structure of molecule 17 1940年，Mann 和 Keilin 报道了磺酰胺能够抑制含有锌的 CA 的荧光1211。1967年，Chen和Kernohan 提出了牛血红细胞CA 和等摩尔的丹磺酰胺(如图18所示)可反应生成高荧光配合物122}。丹磺酰胺的发射波长为 580 nm，荧光量子效率仅为0.055，而结合CA后发射波长蓝移到 图18 分子结构18 Fig.18 Ss1tructure of molecule 18 468 nm， 同时量子效率增大到0.84，并且 Kiefer等发现这种荧光特性不同于酶蛋白 CA和自由的丹磺酰胺的荧光特性。因此，常用结合了芳基磺酰胺荧光团的酶蛋白CA来对Zn²进行荧光测定2 Thompson 在基于 CA 的丹磺酰胺安Zn²+结合方面做了大量的研究[4，24~25]。报报道的磺酰彤-荧光素结合物19(结构如图19所示)126以及dapoxyl磺酰胺20(结构如图20所示)(”是这一类型荧光探针的进一步发展。化合物19能和含有 图19 分子结构19 Fig.19structure of molecule 19 图20 分子结构20 Fig.20 structure of molecule 20 Zn²的 CA 紧密结合(解离常数K=2.30 nmol/L)，荧光各向异性和络合的Zn²浓度在 10 nmol/L~1wmol/L范围内成比例。化合物20络合 CA后荧光强度增大90倍，光谱从605 nm 蓝移到530 nm(解离常数K=3.00 pmol/L)， 通过计算 dapoxyl磺酰胺在535 nm 和 685 nm 处的荧光强度实现对Zn²的定量检测。 1990年以来，绿荧光蛋白类(GFP)探针也见诸于报道。 Getzoff 等报道了一个 GFP 的突变BFPms1(结构如图21所示)，在其共轭生色团位置结合Zn²后，发射波长为 508 nm 的荧光，荧光量子效率达到0.79[28]。 'BFPms1 图21 分子结构21 Fig.211structure of molecule 21 1.4 水杨醛类荧光探针 近年来，针对过渡金属离子具有选择性荧光响应的有机小分子荧光探针的研究也备受关注。报道可见多种以水杨醛酰腙作为金属离子络合 基团的有机小分子荧光探针。水杨醛也称为邻羟基苯甲醛，是制取多种螯合配体的原料。典型的几种基于水杨醛的Zn²+荧光探针有：DSOD，SABAQ， HL等。 梁卓文等91合成的双水杨醛草酰二腙DSOD (如图22所示)，其荧光强度与Zn²的浓度在0~1 umol/L 的范围内呈良好的线性关系，检测下限为 4.6 nmol/L。 图222分子结构22 Fig.22 structure of molecule 22 何慧等[30]设计合成了水杨醛-4-乙氧基苯甲酰肼腙(如图23所所)，Zn²的加入使得该Zn²探针的长波长荧光(530 nm)增强 415倍。 图23 分子结构23 Fig.23 structure of molecule 23 用于粮食中痕量锌测定的物质水杨醛5，7-二溴-8-氨基喹啉 SABAQ(如图24所示)[31其激发和发射波长分别为400 nm 和475 nm，Zn²的含量在0~4.43 umol/L 内与荧光发射强度表现为线性，测量下限为 21.5 nmol/L。 李永强等132]合成了荧光探针水杨醛缩邻氨基苯酚HL(如图25所示)，其激发和发射波长为 图24 分子结构24 Fig.24 structure of molecule 24 405 nm 和517 nm， Zn²的含量在0.01~2.43umol/L 范围内与荧光发射强大成线性关系，检测下限为 7.08 nmol/L。 最近的两篇文献[33~34]最新报道了卟啉等类型的Zn²荧光探针，它们都表现出对Zn²很好的选择性。 2 各类型Zn荧光探针的对比与讨论 根据Zn²荧光探针的激发和发射谱，把Zn荧光探针分为紫外激发，可见光激发，近红外激 发和比例计量型四种类型，并对各类荧光探针的激发和发射特性，量子效率特性等进行了归纳总结与对比，为Zn²+荧光探针的实际应用提供参考。 由表1可知，紫外光激发的Zn²+荧光探针其发射波长都在可见光范围内，这给用肉眼直接观察实验发生提供了条件，避免了激发光对发射光的观察干扰，减小了外界光对实验的干扰，但紫外激发容易对生命细胞产生伤害，也会产生Zn²动力学活动的假象，这在一定程度上也限制了其 表1 紫外激发Zn²荧光探针 Tab.L UV-Excitable Fluorescent Zn’Probes Probe 入 ex/nm 入 em/nm 中，free property free(Zn’t) free(Zn*) (Zn²*) TSQ 334 495 0.1) poisonless， permeable ZinquinA 370 490 permeable ester ZNS1 333 560(475) easily oxidized Dansylamide 326 580(468) 0.055(0.84) good selectivity 在生物体Zn²检测上的应用。 表2总结了可见光激发的Zn²荧光探针，该类探针与紫外激发的荧光探针相比优点在于，当用于细胞 Zn²检测时，可见光大大降低了紫外光对细胞的毒性作用，有效减小了细胞自发荧光干扰，可被大多数有激光光源的仪器(包括激光共 聚焦显微镜及流式细胞仪)有效激发，可见光激发使实时测定细胞中的锌的可操作性增强，观察者不必顾忌紫外光对人眼的损害。 近红外Zn²荧光探针有很好的应用前景，特别是在 650 nm 到 900 nm 的光学窗口下，该类荧光探针的激发光具有穿透皮肤和组织的能力，并 表2 可见光激发Zn荧光探针 Tab.2 Visible-Excitable Fluorescent Zn"Probes Probe 入 ex/nm 入 em/nm ， free property free(Zn?*) free(Zn’*) (Zn²) Zinpyr-1 500 530 0.39(0.87) high autofluorescence ZnAF-1 489(492) 514 0.022(0.23) ZnAF-2 490(492) 514 0.023(0.36) permeable ester ZnAF-1F 489(492) 514 0.004(0.17) ZnAF-2F 490(492) 514 0.006(0.24) permeable ester 只产生极小的自发荧光和低的背景光散射。由表3可知该类荧光探针还有待进一步的研究，目前该类探针仅仅局限于用三碳菁染料作为荧光光。 比例计量型Zn²荧光探针就是荧光探针与锌结合后激发或发射波长发生明显改变，通过测定Zn诱诱导的双发射(或激发)峰的比例变化可实现 对Zn²的定量检测。由于探针分子的量子产率易受环境影响，而自由探针和结合Zn²后的探针受环境影响相似，因此比例计量型荧光探针可以避免检测环境的影响，可实现对Zn²动态变化过程高灵敏度的定量检测。正是由于这一优点，寻找这类探针的研究工作已成为目前Zn²荧光探针研 表3 近红外激发Zn荧光探针 Tab.3 Near-Infrared Fluorescent Zn²Probes Probe A ex/nm 入 em/nm ， free property free(Zn*) free(Zn²*) (Zn") TAEA-IR-780 683 750 good selectivity DPA-Cy 730 780 0.02(0.41) permeable 表4比例计量型Zn²荧光探针 Tab.4Ratiometric Fluorescent ZnProbes Probe 入 ex/nm 入 em/nm ，free property free(Zn²*) free(Zn*) (Zn?t) QQB 350(420) 405(510) (0.03) good selectivity DIPCY 627(671) 758(765) 0.02(0.02) ZnAF-R1 359(329) 532(528) 0.088(0.031) ZnAF-R2 365(335) 495(495) 0.17(0.10) permeable ester Zinbo-5 337(376) 407(433) 0.02(0.10) permeable ester DSOD 395(410) 500(525) good selectivity 究的热点。 3 荧光探针法与微量锌离子测量技术的发展 随着人文素质及生活水平的提高，人们深入认识到微量元素的缺乏和过量都会对健康产生不良影响。因此准确、快速、方便地检测人体微量元素就成为亟需解决的问题。目前Zn²检测方法主要为原子吸收光谱法、分光光度法、离子色谱法等，其中精度最高的是原子吸收光谱法。原子吸收光谱法(AAS，atomic absorption spectroscopy)是根据原子从人射辐射中吸收能量的程度与被测元素的含量成正比，进而通过测量吸收光谱和吸光度，求得被测元素的含量。原子吸收光谱法同时具备高选择性和高灵敏度的优势，火焰原子吸收法的灵敏度是 ppm 到 ppb 级，石墨炉原子吸收法绝对灵敏度可达到10-10~10*g。但是，原子吸收光谱法成本太高，这也是人体微量锌检测无 法普及的重要原因之一。为此人们为Zn²*的检测做了很多新的尝试，马恩陵等135]将离子交换色谱法用于人血清微量元素元的锌定，由业诚等I36]用高效液相色谱光度法用于微量锌离子的研究。而荧光法是目前公认的一种非常有前景的高效、便捷的检测方法，光纤荧光传感技术是其中最有潜力的一种实用化技术。 光纤荧光传感技术是基于荧光效应的，利用光纤作为传感头和传输媒质的光学测量方法。目前光纤荧光传感技术主要用于测量温度17]、血氧I38]和 pH 值39]等。胡春海等[40]根据温度与荧光寿命的关系，设计一种基于荧光寿命的光纤温度传感器，将荧光敏感材料粘贴到被测物体表面实现非接触测温。Sibel Derinkuyu 等设计的光纤荧光 pH值传感器检测范围为7.0~12.0。以上研究证明光纤荧光传感器具有足够的测量精度和实用化前景。而将其应用于微量Zn²检测的核心问题就是获得性能优良的探针分子，这也会促使 人们不断寻找新的荧光团和识别配体来合成新的Zn²荧光探针分子。 4 新探针的研究展望 在开发新的锌探针领域，随着纳米技术的空前发展，一类极具研究和商业前景的材料——量子点荧光探针被期待为微量Zn²的测量提供更好的荧光响应。 量子点是一种三维尺寸均限制在纳米尺度的半导体纳米晶，其特殊的微观结构使它展现出许多不同于宏观体材料的物理化学性质和独特的光学性质： (1)量子点的激发光谱很宽--满足能量大于其最小激发波长的光都可以对其进行激发； (2)性质比有机荧光分子更稳定，可以进行反复多次激发； (3)发射荧光波长可以通过控制量子点的大小和组成的材料来“调谐”。 量子点的光致发光性质与其表面修饰有很大的关系。很多金属离子可以通过不同的作用机制对量子点的光学性质产生显著影响。利用金属离子与量子点作用引起荧光猝灭或荧光增强的变化建立金属离子浓度与荧光强度的关系，从而实现利用量子点探针对金属离子的含量进行测定。已经报道显示，以 CdTe 为量子点核心材料，巯基乙醇为其载体可实现对Zn2+的检测{411。随着量子点技术的不断发展与完善，量子点荧光探针用于微量元素的检测将是今后的研究热点之一。 基于荧光探针的生物体Zn²检测以其选择性好，灵敏度高，成本低等特点无疑是最具潜力的定量测量方法，并且已经证明Zn²的检测分辨率可以达到皮摩尔级。可以预测，随着测试技术的发展和新型荧光探针的不断出现，人体微量锌的检测会逐渐简单化，并开发出通用便携式仪器，而锌离子荧光探针将是其核心。 ( 参考文献 ) ( [ 1 ]Emily L Que， Dylan W d omaille， Christopher J Chang. 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