蛋白中同源二聚体检测方案(大分子作用仪)

SARTORIUS A 应用手册 March 15， 2021 关键词： 生物层干涉技术、BLI、生物分子相互作用分析，双特异性抗体， bsAb， 检测方法开发，结合优化 应用 ProA 和 His1K 生物传感器快速定量筛选双特异抗体的方法 Hongshan Lil， Sriram Kumaraswamy'， Eva Rubio-Marrero，Danyang Huang?，Girish Pendse²1. Sartorius， Fremont， CA 2. Celgene Corporation， Summit， NJ Correspondence Email：Octet@sartorius.com 摘要 生物技术的最新进展推动了双特异性抗体的发展。但对生物工艺和细胞株筛选的研究人员来说，仍然存在许多挑战。许多传统耗时的抗体表征技术并不适用于定量化评估双特异性抗体的两端的结合活性，例如 ELISA、SPR等。 Celgene 公司的科学家开发了一种基于 Octet@平台的筛选流程，建立了高通量筛选高表达双特异性抗体的方法。该方法可以快速筛选双特异性抗体表达量更高的克隆，并且同时测定多项参数，且仅需10分钟即可完成实验条件优化。 1961年 Nisonoff 和 Rivers 第一次报道了双特异性抗体(Bispecific antibodies， bsAbs)， 但双特异性抗体相关的技术挑战限制了其发展'。最近十年，生物技术的进步促进了双特异性抗体的发展。迄今，全球已有两款双特异性抗体药物上市(blinatumomab 和 emicizumab)，超过85个双特异性抗体处于临床研究阶段。由于不同的双特异性抗体来源于不同种属，不同的分子构型(包括对称和非对称的工程抗体片段)，因此在生物工艺开发过程中， bsAbs 的功能评价是关键且具有挑战性的。目前常用的评价方法是 ELISA和SPR， 但都很耗时。因此，亟需一种简单的方法用于复杂的双特异性抗体两种或两种以上相互作用的功能评估2。 细胞表达双特异性抗体会产生不同错配构象的抗体，这对科学家在筛选双特异性抗体细胞株的过程中增加了挑战。如果筛选单纯基于 proA 的滴度检测，一些好的 pool 或者候选克隆可能会被丢弃。为此，我们开发了使用 Octet@RH96系统高通量鉴定双特异性抗体表达量高的 pool和候选克隆。 Octet@RH96系统易于使用和快速处理样品能力使其成为高通量应用极好的选择，例如高表达克隆筛选和双特异性抗体的分子评价。如图3所示，只需要10分钟即可完成双特异性抗体结合活性分析的条件优化。结合 Octet@RH96 系统和浸入即读生物传感器的优点，可以最大限度地减少双特异性抗体方法开发的时间、精力和成本。 +Anti-Penta-His antibody Histidine-tagged antigen 在这里，我们展示了一种在 Octet@系统上用于 bsAb定量分析的简明实验设计(图1)。高通量的 Octet@系统可用于快速筛选高表达 bsAb 的细胞株。分析方法包括在传感器固化不同抗原，随后检测 bsAb 与相应抗原的结合活性。对每一个抗原分子，分析方法开发时需要阳性参比品以及阳性和阴性对照。开发完成的 BLI方法是供了一种简单的筛选方法和工作流程，以通用的、非标记、易于使用的方式评估 bsAb 的结合活性。 材料与试剂 ( ▪安装了操作与分析软件的 Octet@仪器 ) ( ·HIS1K传感器，赛多利斯货号：18 - 5120 ) ·Protein A (ProA)传感器，赛多利斯货号：18-5010 ·平底黑色聚丙烯96孔板， Greiner Bio-One 赛多利斯货号：655209 ·平底黑色聚丙烯384孔板， Greniner Bio-One 赛多利斯货号：781209 ▪用于稀释和预湿传感器的缓冲液 His 标签的 bsAb 特异性的抗原 ( ·bsAb 阳性对照样品 ) 图1： bsAb定量分析流程。分析由五个步骤组成。步骤1：平衡，步骤2：固化 His标签抗原，步骤3：步线，步骤4： bsAb结合， 步骤5： bsAb 解离。 分析方法开发 分析方法开发的主要步骤如下： ·选择生物传感器 ▪注意事项：抗原带什么标签? ▪确定抗原A和抗原B的固化浓度 ·注意事项：抗原的分子量 ▪ bsAb 分别与两种抗原结合(特异性) ▪建立标准曲线(详情参考技术指南153) ·与阳性参比品的结果比较(使用 ProA 传感器测定抗体浓度) 选择生物传感器 赛多利斯 Octet@生物传感器涂有专有的生物相容性基质，均一且不变形，具有最小的非特异性结合。各种传感器在均此基础上衍生得到，可满足不同生物分子的应用。选择生物传感器的种类取决于分析类型。例如，在这些研究中，由于可获得 His 标签的抗原，因此选择用 HIS1K传感器固化 His 标签的抗原。ProA 传感器用于抗体浓度定量。这些生物传感器的优点是即开即用并可以再生。 优化抗原固化 与抗体相比，抗原有不同的分子量大小，所以在固化抗原时，首先需要测试不同浓度的抗原，获得最佳的固化响应信号。本次实验测试了4个浓度的抗原的固化：3、6、12和25 g/mL。抗原稀释于与参比品相同的缓冲液中。在动力学模块下进行分析条件优化。由于该分析是为 bsAb 设计的，因此在30秒的基线步骤后，相同浓度的抗原A和B均采用300秒的固化进行测试(图2)。 B 图2：A)3 ug/mL 抗原固化曲线。B) 12 pg/mL 抗原固化曲线。通常，使用 HIS1K 传感器时将抗原固化信号控制在~0.2nm。 优化 bsAb 结合 为了确定 bsAb 是否与抗原结合以及最佳的抗原固化浓度，阳性参比品的分析浓度使用 3-100 ug/mL。测试 bsAb与固化了抗原的生物传感器结合120秒，然后进行60秒的解离(表1和图3)。 使用 Octet@数据分析软件对结果进行分析。根据不同浓度 bsAb 结合曲线的分离度，选择最佳的抗原固化浓度。bsAb 的结合信号可以导出与 bsAb 的浓度进行函数拟合(图3的步骤4)。所得曲线的线性度可用于确定最佳抗原固化浓度。应选择产生最宽动态线性范围的最小的抗原固固浓度。此外，最高浓度的 bsAb 应未达到饱和状态。还应使用未固化抗原的生物传感器作为阴性对照，I性结合(图4)。通常， 0.2nm的抗原固化信号可以作为抗原固化和bsAb 结合的起始抗原固化信号参考值。 步骤 步骤名称 时间 (s) 震荡速度(rpm) 1 基线 30 300 2 固化 300 300 3 基线2 30 300 4 结合 120 300 5 解离 60 300 表1： Octet分析步骤。不同分析，固化和结合步骤时间可以适当调整。 建立标准曲线 一旦确定了抗原固化浓度、固化时间和样品结合时间，则可建立每个抗原对应的标准曲线。通常，在建立标准曲线时，每个浓度度要重复3次， 且要求 CV值小小10%(图5)。结合 ProA 传感器建立的标准曲线计算样品中的抗体的浓度。最终可通过结合上述 bsAb 与抗原结合活性的结果和proA定量总抗体浓度的结果挑选出最佳的克隆和 pool。 图3： 完整的 Octet@分析 bsAb与特异性抗原结合的案例。低信号的紫色曲线代表阴性对照，传感器未固化抗原和100 pg/mL 的 bsAb 的结合。 为了验证结合试验的一致性，我们使用上述摸索的分析条件，重复测试了不同浓度的阳性参比品。如前所述，分析步骤包括基线、固化抗原、基线、结合、解离(见表1)。同时使用 His1K 传感器分别固化不同抗原分析阳性参比品的结合活性。如果可获得半 bsAb分子，使用半 bsAb 分子对照验证抗原结合活性分析的特异性(数据未展示)。缓冲液作为阴性对照。 使用Octet@数据分析软件选择结合步骤进行数据分析3。通过之前每个抗原生成的的标准曲线分析获得样品的浓度，得到的浓度应接近样品的已知浓度(允许较小的误差)，并且重复性好。从不同抗原标曲计算得到浓度，就可以计算出不同抗原结合活性的比率。由于本次分析的样品为已知的纯度较好的 bsAb， 计算的比率应接近1，但不同样品的比率会有所差异(表2)。对于 pool 和克隆筛选实验，每 次分析都应包含阳性参比品且筛选的 pools 或克隆的比率应接近于阳性参比品。所有5个不同浓度稀释的阳性参比品比率为1.0-1.3，筛选排序分析时变异系数 CV 值应 <30%。 因为在筛选最佳 pool 或克隆时，抗体的表达量也同样重要，抗体的浓度可以使用 ProA 生物传感器以及建立的标准曲线获得。表3显示了一个在96孔板中筛选 mini pool的案例。 Pool在36.5℃培养7天后的上清使用Octet@分析bsAb 的抗原结合活性和抗体浓度。如表所示，如果只是基于 ProA 抗体浓度的排序最前的6个 pool， 其中大部分的pool bsAb 都是低表达。在细胞株开发早期，综合考虑抗体表达量和抗原结合活性比率有助于筛选到高表达 bsAb 的pools。 7厂 样品ID Rep.#1 Rep.#2 Rep.#1 Rep.#2 Rep.#1 Rep.#2 百分比抗原1/抗原 2 百分比抗原1/抗原2 -Rep.#1 -Rep.#2 RS 80 pg/mL 75.2 73.2 89.4 86.2 83.2 82 1.1 1.1 RS 40 pg/mL 36.3 35.9 39.8 39.3 39 38.6 1.0 1.0 RS 20 pg/mL 18.7 18 21 21.8 19.3 19.5 1.1 1.1 RS 10 pg/mL 9.48 9.4 10.1 10.5 8.47 8.74 1.2 1.2 RS 5pg/mL Too low Too low 4.87 5.51 4.17 4.09 1.2 1.3 RS O pg/mL 0 0 0 0 0 N/A N/A 表2：用bsAb阳性参比品和 His 标签抗原结合实验的结果。重复组结果一致说明了标准曲线的准确性。 Mini ProAtiter 抗原1结合 抗原2结合 百分比 pool ID (ug/mL) (rg/mL) (ug/mL) 抗原1/抗原2 1 116.5 59.8 68.4 0.9 2 91.9 54.6 18.3 3.0 3 88 38.5 84.3 0.5 4 85.1 18.6 58.5 0.3 5 80.4 50.8 16.8 3.0 6 57.7 22.3 27.2 0.8 7 56.5 39 2.04 19.12 8 56.3 2.9 48.4 0.06 9 51.7 23.4 29.7 0.8 10 51.5 36.1 3.05 11.8 11 45.9 20.8 27.9 0.75 12 45.7 21.2 28.8 0.7 13 45.6 11.6 22 0.53 14 39.8 2.68 4.89 0.5 15 36.9 17.8 23 0.8 24.4 32 0.8 表3： mini pool 96 孔板筛选结果。高亮显示的 mini pool 与某一抗原的结合活性弱，提示 bsAb 表达量低，因此未被选择用于进一步放大。未高亮显示的 mini pool 是最佳的 pool， 抗体浓度高且和两个抗原都有良好结合活性。 讨论 目前，对市场上双特异性分子的两种结合活性进行功能定量评估依然存在技术瓶颈。在这里，我们展示了一种简单的评估方法。利用 ProA 和 His1K 生物传感器，我们能够快速确定检测条件适合于定量检测 bsAb 双特异性结合活性。 通过 Octet@高通量分析 bsAb 特异性的抗原结合活性以及抗体浓度，我们能够在细胞株开发过程中评估双特异性分子分别与两个靶标的结合活性，从而对最佳的 pools 和克隆进行筛选排序。Octet@结合活性分析的结果已通过其他分析方法进行验证(如RP-HPLC、CE-SDS、SPR和 LC-MS)，结果显示结合活性与所测样品 bsAb 的纯度相关。 ( 参考文献 ) ( Recombination of a mixture of univalent a ntibodv fragments of d i fferent s p ecificity， N isonoff A， Rivers MM， Arch B i ochem Biophys， 1961； May；93：460-2. ) ( 2. Bispecific antibodies： a mechanistic review of thepipeline， Labrijn AF， Janmaat ML， Reichert JM andParren PWHI， N ature Reviews Drug Discovery， 2019Aug；18(8)：55-608. ) ( 3. Technical Note 15， H igh S ensitivity Detection o f Human I gG Using Protein A Biosensors. ) 销售与服务联系方式 更多联系信息，请访问 WWw.Sartorius.com.cn 赛多利斯(上海)贸易有限公司 邮箱 lab.cn@sartorius.com 服务热线400 920 9889|800 820 9889 上海 北京 上海市浦东新区盛荣路 388 北京市顺义区空港工业区B弄百佳通产业园3号楼， 7-11 区裕安路33号，101300层，200120 电话+86 10 8042 6300 电话+86 21 6066 6100 苏州 广州 苏州市虎丘区科技城锦峰路广州市越秀区水荫路 117号 158 号 101park-28 幢201，1105 单元， 510075 215163 电话+8620 37617284 电话+86 512 6616 0490 成都西安成都市上东大街246号新良西安市和平路 118号和平银大厦 2406 室， 610012座1107室， 710001电话+86 28 8666 6877电话 +86 29 87512305 ( 技木规格如有变更，恕不另行通知。 ) ( 赛多利斯保留最终解释权和修改权。 ) ( 版本06|2021 ) 更多信息，请访问 www.sartorius.com.cn Octet双特异性抗体（BsAbs）是同时可以结合两个靶点的抗体药物，可以将效应细胞直接作用于靶向肿瘤细胞，提高抗体的选择性，改善药物的安全性和有效性。与两种单抗混合治疗相比，双特异性抗体可以降低开发和临床成本，是当下抗体药物开发的香馍馍。预测2025年双特异性抗体全球市场规模将达到80亿美元【1】。美国FDA在2021年5月底颁布了最终版的《双特异性抗体研发指导原则》【2】。下面是此文的CMC quality consideration(生产工艺质量属性研究)部分：亲和力（affinity）大家都很熟悉了，以前关于生物药物活性的一些指导原则中经常出现。这次双抗指导原则中的on-rate和off-rate是啥东东呢？“打开/关闭速率”？当然不是，这两个词的正确描述是（双特异性抗体与两个抗原间的）“结合速率”与“解离速率”。关于检测on-rate和off-rate两个分子（A和B）的结合实际上是动态可逆的过程。A和B结合的同时，解离也同时发生，所以通常用结合速率与解离速率来表征其相互作用的速率，亦称为动力学表征。动力学表征参数包括：· On-rate：结合速率常数, 用kon或者Ka表示。该参数代表配体（A）和分析物（B）之间的结合速率。每1M的A分子和B分子每秒产生的复合物数量，单位为 M-1s-1。· Off-rate：解离速率常数, 用koff或者Kd表示。该参数反映了复合物（AB）每秒钟发生解离的量的百分比。koff越大，解离越快，单位为s-1。· KD：平衡解离常数，用KD表示。KD代表了两个分子相互作用结合能力的强弱，也就是我们通常所说的亲和力（affinity），其数值等于Koff/Kon。BLI技术是列入美国药典中的检测动力学方法之一应用基于BLI技术的Octet分子互作分析系统，能够非标记、实时地检测两个或多个分子间的动力学参数。常规方法如下：先将A分子（配体）固化在传感器上，然后通过和B分子（分析物）的相互结合\解离这两个步骤来获取这些参数。第一个步骤是结合，即将固化了A分子的传感器浸入到含有B分子的溶液中进行结合反应，通过特异性结合生成AB复合物。第二步是将含有AB复合物的传感器浸入到不含B分子的缓冲溶液中进行解离。分析软件将根据实时的结合/解离曲线分析得到kon和koff值。亲和力（KD）的数值通常用ELISA这些传统技术也能获得。而动力学参数Kon和Koff就只能通过以BLI技术为代表的实时非标记检测技术来进行检测。目前BLI技术已经被美国药典列为动力学表征的互作方法之一，详见15年的等待！BLI技术正式列入《美国药典》（USP-NF）。on-rate和off-rate的重要性为什么这次发布的指导原则提出需要提供on-rate和off-rate这两个重要的参数呢？这个就要从BLI技术和传统的ELISA等方法的差别说起。· ELISA是终点法（End Point）检测，无法获得解离\结合速率快慢的过程信息，而这些信息往往比单一的亲和力值（KD）更重要；· BLI技术在偶联配体时，可以避免疏水包被导致的抗原表位丧失；· BLI技术可以很好的检测nM~pM范围内的亲和力，而且重复性好；· 整个检测过程无需洗涤步骤，特别适合检测解离较快的弱结合。· Octet自动化，节约大量人工成本，比如Octet RED384和HTX还可以整合机械臂。在杂交瘤上清中用Octet的传感器固化不同抗体，对同一浓度的抗原进行结合解离的曲线，综合考虑On-rate和off-rate对抗体进行评估Octet检测双特异抗体案例分享目前已经有很多篇文章或者专利用Octet检测双抗的亲和力，这里陈老湿就引用NIH（美国国立卫生研究院）的一篇文章以供大家学习【3】。该作者设计了一些HIV的中和抗体，其中一种名为VRC07 X 10E8的双特异抗体可以同时识别CD4和gp41的MPER（近膜结构域）两种抗原，其VRC07针对CD4，而10E8针对MPER。用AHC（anti-human Fc）传感器固化抗体，检测CD4和MPER，发现双特异抗体的亲和力与母本的一致。用SA或者AR2G固化CD4，然后依次结合双特异抗体和MPER，发现双特异抗体可以同时和两个抗原结合。另外，这次发布的双抗开发指导原则的CMC quality consideration内容中，还提到需要检测同源二聚体的污染物，Octet对此有专门的应用方案，文末有下载哈！该指导原则强调了koff和kon动力学检测的重要性。简而言之就是仅仅做亲和力表征已经不够用啦，还要检测on-rate和off-rate这两个动力学参数。不仅对双特异性抗体如此，其他抗体药物也要检测与靶点或者Fc受体的动力学参数。由于传统方法的各种局限性，基于动力学的检测方法也会被越来越多地用于法规要求中。Download Octet检测同源二聚体的污染物的方案-参考文献-[1]https://www.prnewswire.com/news-releases/global-bispecific-antibody-market-to-2025-drug-sales--clinical-pipeline-insights-with-an-8-billion-market-opportunity-300780848.html).[2]Bispecific Antibody Development Programs Guidance for industry(FDA).[3] Bispecific Antibodies Targeting Different Epitopes on the HIV-1 Envelope Exhibit Broad and Potent Neutralization. Journal of Virology. (2015). 89:24.