生物样品中肽段检测方案(液质联用仪)

关键词 TSQ Quantiva；肽段定量；灵敏度 前言 生物标志物的研究包括发现( Discovery)，验证(Verification)，确认(Validation)阶段，最后进入临床检验(ClinicalUtilization)等更深入的阶段。在研究生物标志物的过程中，主要的挑战在于如何在成分复杂的生物样品中发现中等丰度或低丰度的蛋白质，这就对仪器性能提出了很高的要求，即仪器必须具备高灵敏度，以保证低丰度蛋白质的检出。 TSQ Quantiva 是赛默飞世尔科技在2013年 ASMS 上推出的全新一代三重四极杆质谱仪。 TSQ Quantiva 采用主动离子管控技术 (Active lon Management， AIM)(图1)技术优化离子生成及从离子源至检测器的传输，使这款仪器能够以最优异的灵敏度定量分析最复杂和最具挑战性的样品。本实验旨在考查 TSQ Quantiva 在复杂基质中针对目标肽段定量的灵敏度。 图1.主动离子管控技术(AIM)示意图 实验条件 材料与方法 PIERCE Peptide Retention Time Calibration Mixture ( 货号：88320)，内含15条不同疏水系数(Hydrophobicity Factor， HF)的重标肽段。采用 5ng/pL E.coli 酶解产物进行逐级稀释，获得浓度为 0.0005 fmol/pL， 0.0025 fmol/pL， 0.005 fmol/pL， 0.05 fmol/uL， 0.5 fmol/pL， 5 fmol/ uL， 50 fmol/uL的样品。实验中通过Pinpoint 1.3软件进行离子对的选择(图2)，每个母离子选择4个子离子，其中1个子离子作为定量离子，3个子离子作为定性离子。最终建立了15条目标肽段，共计60个离子对的 SRM 方法，其中加粗部分为定量离子(表1)。 图2. Pinpoint 1.3软件进行离子对的选择 表1.15条肽段信息 576.4 20.7 y5 IGDYAGIK* 19.15 422.7 731.4 19.7 y7 674.4 19.7 y6 559.3 19.7 y5 325.2 19.7 y3 TASEFDSAIAQDK* 25.88 695.8 1002.5 28.9 y9 469.2 28.9 y4 855.4 28.9 y8 1218.6 26.8 y11 SFANQPLEVVYSK* 34.96 745.4 942.5 30.7 y8 405.2 30.7 y3 504.3 30.7 y4 1184.6 28.8 y10 LTILEELR* 37.30 498.8 782.5 22.3 y6 669.4 22.3 y5 556.3 22.3 y4 883.5 22.3 y/ ELASGLSFPVGFK* 41.19 680.4 555.3 28.4 y5 789.4 28.4 y/ 1046.6 28.4 y10 1117.6 27.3 y11 LSSEAPALFQFDLK* 46.66 787.4 1086.6 31.2 y9 805.4 32.1 y6 543.8 32.1 y9 1157.6 30.5 y10 高效液相色谱分离 高效液相色谱仪： Thermo Scientific EASY-nLC 1000 预柱： Dionex PepMap Cig色谱柱(2cm， ID75pm， 3pm) 分析柱： Dionex PepMap C18 色谱柱(15cm， ID75pm，3pm) 流动相：A，含0.1%甲酸的水溶液；B，含0.1%甲酸的乙腈溶液 梯度：： 22%-5% B 2 min， 2%-45% B 42min， 45%-90%B 3 min，90%B 3min 流速：300nL/min 上样量：2pL 质谱分析 质谱仪：Thermo Scientific TSQ Quantiva 离子源： NanoFlex离子源 离子模式：正离子 喷雾电压：2.0KV 毛细管温度：275℃ Q1 and Q3 resolution： 0.7Da： Cycletime： 2s 碰撞能量：通过公式 CE=0.034×母离子的m/z+5.314计算得到相应肽段的碰撞能量，并在此基础上 CE加减2进行进一步优化，选择最优碰撞能量。 本实验采用全新一代三重四极杆质谱 TSQ Quantiva 对复杂基质中15条重标肽段进行定量分析，均可获得良好的色谱峰形和质谱响应(图3)。以肽段SSAAPPPPPR*为例，检出限为(LOD)1amol，定量下限(LLOQ)为5amol(图4)。如图5标准曲线所示， 在 5amol-100fmol 五个数量级浓度范围内，浓度与峰面积的线性相关系数在0.99以上，同时，在 amol 级水平仍可获得良好重复性(图6)。15条肽段的标准曲线和线性范围参见表2。 图3.15条肽段总离子流图(TIC)(上样量100fmol) 图4.肽段 SSAAPPPPPR*不同上样量提取离子流图(EIC)m/z493.8->m/z335.7 图 5.肽段 SSAAPPPPPR*标准曲线 图6.肽段 SSAAPPPPPR*在 amol 水平重复性 表2.15条肽段标曲和线性范围 肽段 标准曲线 线性范围 HVLTSIGEK* y=40.1x+1956.7R²=0.9997 W： 1/X 100amol-100fmol SAAGAFGPELSR* y=256.7x+717.5 R=0.9994 W： 1/X 5amol-100fmol ELGQSGVDTYLQTK* y=36.5x+12.8R²=0.9994 W：1/X 5amol-100fmol GLILVGGYGTR* y=198.9x+233.6R²=0.9993 W： 1/X 5amol-100fmol GILFVGSGVSGGEEGAR* y=101.4x-358.7R²=0.9988 W： 1/X 5amol-100fmol NGFILDGFPR* y=72.6x-3284.6R=0.9996 W： 1/X 10amol-100fmol SSAAPPPPPR* y=933.3x+171.2R²=0.9991 W：1/X 5amol-100fmol GISNEGQNASIK* y=153.9x-361R²=0.9995 W：1/X 5amol-100fmol DIPVPKPK* y=276.2x-3206.7R=0.9964 W：1/X 100amol-100fmol IGDYAGIK* y=498.3x+82063.6R²=0.9998 W： 1/X 100amol-100fmol TASEFDSAIAQDK* y=94.5x+877.5R²=0.9989 W：1/X 10amol-100fmol SFANQPLEVVYSK* y=102.6x-195.1R²=0.9989 W： 1/X 5amol-100fmol LTILEELR* y=151.5x-1340.4R²=0.9988 W：1/X 10amol-100fmol ELASGLSFPVGFK* y=23.5x+297 R²=0.9992 W： 1/X 10amol-100fmol LSSEAPALFOFDLK* y=29.9x-318.0R²=0.9953 W：1/X 10amol-100fmol 结论 实验表明，得益于主动离子管控技术(AIM)， TSQ Quantiva在复杂基质中针对目标肽段的定量灵敏度表现突出，极大 地提升了 TSQ 质谱平台定量复杂基质中目标肽段的能力，适用于复杂生物学样本中低丰度蛋白质的分析，，可用于潜在生物标志物的确证工作。 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 免费服务热线：80081051184006505118(支持手机用户) ThermoFisherSCIENTIFIC AN_CM 实验表明，得益于主动离子管控技术（AIM），TSQ Quantiva在复杂基质中针对目标肽段的定量灵敏度表现突出，极大地提升了TSQ 质谱平台定量复杂基质中目标肽段的能力，适用于复杂生物学样本中低丰度蛋白质的分析，可用于潜在生物标志物的确证工作。