马钱子主要有效成分士的宁(strychnine)又名番木鳖碱,属于中枢神经兴奋剂,临床用于偏瘫、瘫痪及因注射链霉素引起的骨骼肌松弛、弱视症和巴比妥类中毒等。此外,添加士的宁的饲料诱饵可用来消灭老鼠等啮齿类有害动物,然而这些动物体内残留士的宁会通过食物链传递, 对整个生态圈造成影响,故有必要对其代谢产物进行深入研究,为临床用药、环保、司法等部门提供可靠的分析手段和数据。
LTQ Orbitrap XL结合了线性离子阱和Orbitrap高分辨质量分析器,具有高灵敏度的多级高分辨能力。Mass Frontier为赛默飞专业的结构解析软件,利用其丰富的碎裂数据库,可快速对士的宁多级碎裂规律进行准确推测和归属,碎片离子检索功能将母药与代谢物相关性与可能的代谢途径有机的结合起来,从繁杂的基质样品质谱信号中准确的筛选到未知代谢物信息,进一步对代谢位点进行推测,最终获得全面的代谢物信息。
周哲5江峥 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词::碎片离子检索,FISh, 代谢物, LTQ Orbitrap 1.引言 马钱子为马钱科植物马钱 Strychnos nux-Vomical L.的干燥成熟种子,其主要活性成分是生物碱,具有通经络、消肿痛、止痛的功效,是中医临床常用药物。其中主要有效成分士的宁( strychnine)又名番木鳖碱,属于中枢神经兴奋剂,能选择性兴奋脊髓,增强骨骼肌的紧张度,临床用于偏瘫、瘫痪及因注射链霉素引起的骨骼肌松弛、弱视症等和巴比妥类中毒等。但这类成分有剧毒,作为药用必须严格控制其用量。此外,添加士的宁的饲料诱饵可用来消灭老鼠等啮齿类有害动物。然而这些动物体内残留士的宁会通过食物链传递,对整个生态圈造成影响。因此有必要建立快速、灵敏、准确的方法检测该类药物,为临床用药、环保、司法等部门提供可靠的分析手段和数据。 本文采用高效液相色谱-离子阱静电场轨道阱高分辨质谱联用技术对士的宁及其代谢产物进行了全面的分析,利用线性离子阱技术对目标化合物进行 MS" 多级碎裂, 并通过 Orbitrap静电场轨道阱技术获得一级和多级质谱的高分辨质谱信息。Mass Frontier 7.0 结构解析软件具有丰富的裂解机理数据库能够进行准确的碎片归属,其独有的碎片离子检索( FragmentIon Search, FISh) 功能将母药和代谢物共有碎片及代谢途径有机结合到一起,可以检获代谢物的全面信息。 2.1液相色谱条件: 仪器: Accela HPLC system 液相色谱仪 色谱柱: Thermo Scientific Hypersil Gold C18 (100×2.1 mm, 1.9 pm)流动相:A为水相:0.05%甲酸2mM 甲酸铵水溶液, B 为有机相:0.05%甲酸2mM甲酸铵乙腈溶液 梯度条件: 1侣 流速0.2 mL/min, 进样量:5uL,柱温为30℃ 2.2质谱条件 仪器: Thermo LTQ Orbitrap XL 质谱离子源参数: ESI Spray voltage: +4.0 KV; SheathGas Pressure: 35 arb; Aux Gas Pressure: 8 arb; CapillaryTemp: 275℃; Scan mode: Full MS with data-dependentMSn; CID ( collision energy 35%, activation time 30 ms);Scan range: m/z 200~700。 2.3样品制备 按5mg/kg 剂量口服喂食雄性大鼠士的宁,6小时后取大鼠尿样, SPE固相萃取纯化富集,取适量稀释后进样分析。 3.1代表性组分查找 采用 Mass Frontier 的联合组分检测( Joint ComponentsDetection )算法,对质谱数据中的代表性组分进行查找。基于所有离子轮廓图最大值的统计分析,通过提取各个质谱峰丰度轮廓图,可创建出士的宁母药及其他可能代谢物的“纯净”质谱树,并生成相应的峰形(图1)。 图1.联合组分检测(Joint Components Detection) 算法查找代表性组分 3.2士的宁碎片结构解析 在获得士的宁“纯净”质谱树后,使用 Mass Frontier 碎裂数据库( Fragmentation Library), 可快速的对士的宁碎片结构进行归属,该数据库几乎涵盖了所有已发表的文献,所以在快速解析碎片的同时,可获得完整的碎片裂解途径,并可方便的调用查看所引用的文献情况,保证了碎片解析的准确性(图2)。 图2.碎裂数据库(Fragmentation Library) 归属士的宁碎片及裂解途径 3.3士的宁完整裂解机理 LTQ Orbitrap XL的线性离子阱相比传统三维离子阱具有更高的离子容量,故具有优异的多级质谱能力,能够高效的捕获前级离子进行碎裂,并获得高灵敏度的碎片离子信息,在对士的宁母离子的采集过程中,获得了其四级有效质谱信息(MS)。通过多级质谱解析,总结出士的宁完整裂解机理,为未知代谢物检索带来有价值的信息(图3)。 图3.士的宁 MS4 离子树及完整裂解机理 3.4碎片离子检索(Fragment Ion Search, FISh)工作流程 碎片离子检索功能利用母药和代谢物的结构相关性,采用母药的特征质谱碎片,结合代谢途径,完成对未知代谢物的检索。利用该功能,在完成了士的宁母药的质谱裂解规律后,将特征碎片导入 FISh 模块中,并选择可能的代谢途径,结合代表性组分查找,检索士的宁未知代谢物的全面信息(图4)。 图4.碎片离子检索士的宁未知代谢物工作流程 通过碎片离子检索获得准确全面的未知代谢物信息,包含未知代谢物色谱信息、一级多级质谱数据、未知代谢物代谢途径等信息,同时 FISh 解释功能还可以通过母药及代谢物多级质谱信息之间的比对,进一步对代谢位点进行推测(图5)。 图5.士的宁未知代谢物检索鉴定结果 以 RT 11.5 min 的未知代谢物为例,通过FISh计算,获知该未知代谢物为羟基化代谢产物,通过 FISh 解释功能比对264.1、280.0、323.1、334.2、238.0 m/z等特征碎片,推测出该代谢物为 16-Hydroxystrychnine(图6)。 图6.士的宁代谢物16-Hydroxystrychnine 使用相同处理方法,共检测到士的宁26个代谢产物,其中一相代谢产物22个,二相代谢产物4个,见表1。 表1.士的宁代谢产物鉴定结果 Metabolite m/z实测值 m/z理论值 偏差(ppm) 计算分子式 R.T.(min) Identification M 335.17567 335.17540 0.79 C21H22ON, 9.35 (Parent) Strychnine M 351.17050 351.17032 0.515 C2H3O,N, 5.83 2-Hydroxystrychnine 351.17078 351.17032 1.31 C2HON, 6.57 22-Hydroxystrychnine M, 351.17068 351.17032 1.03 C2H23O,N 7.55 Strychnine 21,22-epoxide M 351.17072 351.17032 1.14 C21H23O2N2 9.24 16-Hydroxystrychnine Ms 351.17100 351.17032 1.94 C21H23O2N2 10.86 StrychnineN19-oxide M 351.17075 351.17032 1.13 C2H23ON, 11.37 Strychnine-N9-oxide M 353.18604 353.18597 0.198 C2HON, 7.43 21-Hydro-22-hydrostrychnine M 369.18097 369.18088 0.234 C2H23ON 6.32 210,22a-Dihydroxy-22-hydrostrychnine M. 369.18100 369.18088 0.315 C21H23O4N2 7.22 21a,22B-Dihydroxy-22-hydrostrychnine Mio 369.18103 369.18088 0.396 C21H23ON2 8.12 Dihydroxy-22-hydrostrychnine M 365.18649 365.18597 1.42 CzH25O,N, 10.81 methoxylation Mi2 365.18634 365.18597 1.02 C,HO,N 11.46 2-Methoxystrychnine M13 365.18646 365.18597 1.34 C22H25O3N2 11.87 methoxylation M14 367.16528 367.16523 0.136 C21H23ON, 3.59 Dihydroxystrychine M15 367.16537 367.16523 0.381 C21H23ON2 4.51 2,3-Dihydroxystrychine M16 367.16531 367.16523 0.218 C21H23ON2 5.10 Dihydroxystrychine M, 367.16537 367.16523 0.381 C2HON 6.09 2,16-Dihydroxystrychine Mi: 367.16534 367.16523 0.300 CzHON 7.15 Dihydroxystrychine M19 367.16541 367.16523 0.490 C21H23O4N2 7.83 Dihydroxystrychine M20 367.16544 367.16523 0.572 C21H2304N, 8.74 Strychnine-21,22-epoxide-N-oxide M21 333.16028 333.15975 1.59 C21H2102N2 9.21 11,12-Dehydrostrychnine M, 333.16049 333.15975 2.22 CHON 15.90 Dehydrostrychnine M23 527.20251 527.20241 0.19 C27H31OgN2 2.60 Glu conjugate ofM M24 527.20239 527.20241 0.04 C2H31O,N, 3.62 Glu conjugate ofM, M25 527.20251 527.20241 0.19 C2-H3ON, 5.02 Glu conjugate ofM, M26 511.20755 511.20749 0.12 C-HON, 7.38 Glu conjugate ofM, 4.1 Thermo LTQ Orbitrap XL 质谱仪将线性离子阱与高分辨静电场轨道阱 Orbitrap 检测技术相结合,提供优异的性能和出色的多功能性。线性离子阱更高的离子容量能够高效的捕获前级离子进行多级碎裂,获得高质量的多级质谱图,本实验通过线性离子阱逐级裂解剖析了士的宁完整裂解机理。Orbitrap 技术具备高分辨高质量精度(HR/AM)的能力,本实验中士的宁代谢产物质量偏差<3 ppm, 能够有效的排除干扰,获得代谢物准确的元素组成。 4.2 Mass Frontier 为 Thermo 专业的结构解析软件,利用其丰富的碎裂数据库(Fragmentation Library ),可快速的对士的宁多级碎片结构进行了准确推测和归属,在快速解析碎片的同时,可获得完整的碎片裂解途径,并可方便的调用查看所引用的文献情况,保证了碎片解析的准确性。母药和代谢物存在结构相关性,质谱多级碎裂后可能生成共有碎片,碎片离子检索(FISh)功能将这种相关性与可能的代谢途径有机的结合起来,从繁杂的基质样品质谱信号中准确的筛选到未知代谢物信息,通过比对母药和代谢物多级质谱信息,,FISh解释功能更可进一步对代谢位点进行推测。 SCIENTIFIC ThermoFisherS CIENTIFIC赛默飞世尔科技(中国)有限公司免费服务热线: 支持手机用户)客服邮箱: sales.china@thermofisher.com
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