活细胞钙离子浓度荧光显微镜检测系统的研制和应用

生物医学工程研究Journal of Biomedical Engineering Research 115兰 李，等.活细胞钙离子浓度荧光显微检测系统的研制和应用第2期 活细胞钙离子浓度荧光显微检测系统的研制和应用 兰 李，周云燕，杨志勇，瞿安连，徐 涛 (华中科技大学生命科学与技术学院生物物理与化学研究所，湖北武汉430074) 摘要：研制了活细胞钙离子浓度荧光显微检测系统。该系统的工作原理是：氙灯发射的光线被椭球面镜聚焦后以衍射光栅分光，通过光纤、双路耦合聚光镜和物镜将单色光纤入样本平面以激发细胞中的钙离子荧光探针发出荧光，最后用光电倍增管检测荧光信号。使用该系统，测定了高K去极化刺激下 PC12细胞(大鼠嗜铬细胞瘤细胞)内[Ca²+]i变化的动态特性曲线。结果表明：静息状态下 PC12细胞内[Ca+]i为80.0 ±15.0nmol/L，高K*去极化刺激可使 PC12细胞内[Ca*]i增加到1.9±0.2uml/L，上升至峰值时间约为20.1s。表明此系统可以满足检测活体细胞[ Ca²+]i的需要。 关键词：荧光显微镜；胞内钙离子浓度；椭球面镜；双路耦合聚光镜；PC12细胞；高钾去极化 中图分类号：Q-336；R318 文献标识码：A 文章编号：1672-6278(2004) 02-0114-04 Development and Application of the Fluorescent Microscopy Systemfor Detecting [ Ca]i in Living Cells LANLi， ZHOU Yun-yan，YANG Zhi-yong，QU An-lian，XU Tao (Institute of Biophysics and Biochemistry， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430074 China) Abstract ： The fluorescent microscopy system to detect [Ca]i in living cells was build. In this system， the light from the xenon lightsource was converged by elliptical mirror and diffracted by diffraction grating； then the optical fiber and dual-coupling condensor transmittedmonochromatic light to the specimen plane to generate the fluorescence of the fluorescent probe within the cell； at last the fluorescent signal wasdetected by the photomultiplier tube. Using this system， the dynamic curve of [Ca*]i in PC12 cells after high K*depolarization was given.The results showed that the resting levels of [Ca *]i in PC12 cells were 80.0 ±15.0nmol/L. After high K* depolarization was given， the conrcentrations of intracellular free [Ca]i in PC12 cells were raised by 1. 9 ±0.2umol/L， and the time of high-K* depolarization stimulating[Ca+]i elevation to a peak point was about 20. 1s. These results verify that this system is suitable for detecting [Ca*]i in living cells. Key words ：Fluorescent microscope； Intracellular Ca’t concentration ([Ca*]i)； Elliptical mirror； Dual - coupling condensor； PC12cells； High K depolarization 采用钙离子荧光探针对细胞内钙离子等信使物质进行定量测定是研究细胞分泌活动的重要技术手段。其基本原理是：用荧光探针标记样本中的钙离子，根据样本中的荧光探针特性单色光源发出单色光，诱发出荧光。然后根据传感器检测到的荧光特性即可分析样本中的钙离子浓度。在目前的生理学研究中，仅测量细胞中的静息钙离子浓度是不够的，通常需要在监测过程中改变钙离子浓度以定量研究各因素对分泌的影响。Ca²+螯合物DM- nitro- phen 和Nitrophenyl EGTA 可用于快速且均匀的提升细胞内钙离子的浓度，将此物质与 Ca 染料通过膜片钳电极或孵育的方法导入细胞内，然后经过高能量的紫外光激发，使Ca²+螯合物瞬时分解，钙迅速且均匀升高。这种技术称为钙离子光解释放技术。现代生理学研究中，钙离子荧光标记检测技术与光解释放技术常结合使用。我们研制的以荧光标记法为基础的活细胞钙离子浓度检测系统(下称为荧光测钙系统)即基于上述原理，在提供对胞内钙离子定 ( *基金项目：国家自然科学基金资助项目(30327001) ；国家自然科学基金资助重点项目(30130230)。 ) ( 作者简介：兰李(1979-)，男，华中科技大学硕士研究生。 ) 量检测手段的同时，兼顾光解释放实验的需要。 1 仪器设计 荧光测钙系统可分为单色光源、荧光显微镜、荧光采集系统(包括光电倍增管、CCD和监器)3个主要部分，见图1。由于需要同时引入光解释放激发光，故设计了双路耦合聚光镜以引入两路光。此系统中单色光源提供单色激发光，随后光纤与双路耦合聚光镜将激发光引入荧光显微镜；荧光显微镜将激发光聚焦于样本平面以诱发荧光：荧光采集系统采集并记录荧光信号。计算机控制单色光波长的切换、荧光信号的采集以及实验数据的初步处理。 图1荧光测钙系统结构 Fig 1 Structure of the fluorescence microscopy systemfor detecting [Ca*]i 我们的工作主要集中在单色光源双路耦合聚光镜与荧光采集系统的研制上。按系统的运行顺序对各部分的新颖性作出说明。 1.1 基于椭球面镜的单色光源 见图2。 图2 单色光源光路原理图 Fig 2Schematic diagram of monochromator 本研究的主要工作原理是将氙灯光源发出的光线聚焦后准直，再由光栅分解为单色光。其关键部件为氙灯的聚光镜。国外同类产品采用的是难以加工的环面镜，不适合本单色光源使用，因此，我们使用易加工的椭球面镜作为系统的聚光镜。通过软件模拟，相同条件下椭球镜的实际可用汇聚能量是环面镜的1.8倍。即使椭球镜的安装与调试比环面镜 困难，此方案还是可取的。按此方案构建单色光源的输出功率-波长曲线(光谱输出)，见图3，曲线中横坐标为波长，纵坐标为对应的输出光功率。图3中带有标记1的为德国 TILL Photonics GmbH 的 Poly-chrome-Ⅳ在相应波长的光功率输出，标记2为同一家公司的 Polychrome -Ⅰ在相应波长的光功率输出。Polychrome-Ⅳ采用150W氩灯，Polychrome-Ⅰ与本单色光源采用 75W氩灯。由此可见，本光源的输出功率基本与 TLL Photonics GmbH的同类产品相当，而且在可见光谱段输出稳定，表明此光源不仅可以满足荧光测钙的需要，而且可满足诸如绿色荧光蛋白检测、FM染料检测等多种不同实验的要求。 图3 单色光源光谱输出 (采用 Coherent Auburn Group公司(USA)出品的 Field-master GS 型光功率计测量) Fig 3 Spectral output of monochromator (measured by the power analyzer Fieldmaster GS， Coherent Auburn Group， USA) 1.2 简洁实用的双路光纤耦合镜 双路耦合聚光镜主要功能为：(1)将光纤出射的单色光与光解激发光按显微镜物镜参数准直后引入显微镜；(2)将单色光与光解激发光按一定比例进行配比输出。为实现功能1，设计了优化的四片式光学结构，进行了精细的像差矫正、采用了针对所用波长的增透膜并构建了一体化的机械支架，从而保证样本平面上获得了足够且均匀的照明。为实现功能2，采用二色分光镜实现两路光源的特定配比输出。 1.3 高灵敏度、高信噪比的检测机构 由于钙离子实验中的输出的荧光信号既微弱且信噪比较低，故使用HAMAMATSU Photonics KK公司的高灵敏度H5784-2型光电倍增管作为检测器，同时在检测器外围设计了增益电路与低通贝赛尔滤波电路，以提高输出信号的品质。 2 实验部分 利用所开发的荧光测钙系统，研究了高K刺激对 PC12细胞(大鼠各铬细胞瘤细胞)内游离钙离 子浓度的影响。 2.1 试剂与溶液 HEPES， Glucose 及其它常用试剂均系 Sigma 公司产。Frua- 2/ AM 为 Molecular Probe 产品。 2.1.1 标准细胞外液 NaCl 135mmol/L， KCl2mmol/L，MgCl2.6H2O 2mmol/L，HEPES 10mmol/L，Gucose 4g/L ， CaCl2.2HO 5mmol/L pH=7.2渗透压310 mmol/L 2.1.2高K刺激液 NaC77mml/L， KC 60mml/L， MgCl2.6HO 2mml/L，HEPES 10mml/L， Gucose 4g/L， CaCl2.2HO 5mml/L pH=7.2渗透压295 mml/L2.1.3IFura -2/AM荧光试剂的配制 (1)助溶母液(Pluronic stock) 1g Pluronic F- 127+5ml DMSO(20%W/V)；(2) Fura -2/ AM 母液 50ug Fura-2/AM+50ul Pluronic stock +10ml 细胞外液(-20℃保存)；(3)最终溶液 250pl Fura-2/AM母液+0.5ml细胞外液。 2.2 仪器与设备 自制荧光单色激发光源、显微镜(AxiovertS100TV， ZEISS； Germany)、物镜(UplanApo， 100×1. 35 Oil lris Olympus； Japan)、光纤(中=1.25mm，NA=0.25)、自制荧光信号检测装置、数据采集系统(EPC9， HEKA Elektronik GmbH； Germany)、数据采集及光源控制软件(Pulse ，HEKA Elektronik GmbH； Germany)、数据处理软件(Igor Pro 4.03)。 2.3PC12细胞培养[2] 复苏后的 PC12细胞接种于25ml培养瓶中，置于CO培养箱中培养(37℃、5%CO2)。隔日更换培养液，培养液的成分为：CMEM85%，马血清10%，胎牛血清5%，pH 7.2~7.4。待细胞铺满瓶底，用0.25%胰蛋白酶消化，消化完全后加入 DMEM+10%小牛血清终止消化，用吸管吹打均匀，接种入培养板(内含预先用0.1%多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)处理的载玻片)中。培养24h后用于测定细胞内钙离子浓度。 2.4 细胞内游离[Ca*]i测定过程 贴壁培养的细胞载玻片用细胞外液清洗两次后，浸泡在 Fura - 2/ AM负载溶液中37℃避光培育20min ，让荧光染料充分进入细胞。随后取出载玻片再用细胞外液洗2次，在荧光测钙系统上测定单个细胞的荧光强度。激发波长为340nm 和380nm，发射波长为505nm。在一定时刻内用微量进样器小心加入高K刺激液，观察它对所测细胞内荧光强度的影响。 2.5 结果与讨论 2.5.1 胞内游离[Ca]i计算 采用双波长荧光测钙法测量PC12细胞内游离钙离子浓度。即将胞内荧光探针在不同激发波长(340nm、380nm)发射的荧光强度值，代入以下公式求出[Ca *]i： 其中R为两种激发波长下荧光强度的比值，即R=F(340)/F(380)，为排除背景光的干扰，可减去背景光强度，即R=F(340)- F(280)/F(380) - F(280)； Rmin 与Rmax分别对应钙离子浓度最小(零钙)和最大(10mmol/L)时的R值，Kef为有效结合常数。 2.5.2高K 去极化刺激对胞内[Ca ]i的影响 本实验观察了高浓度的K 溶液对 PC12细胞内[Ca ]i的影响。实验中每个细胞采样400次，一次采样时间55ms，其中激发光波长340mm下激发时间为15ms，380mm 下 15ms，其余时间保持激发光波长为静息波长(280nm)，采样频率 10kHz。其中一次测量结果见图4：前135s 内，测定细胞静息状态下游离钙离子浓度，开始阶段由于进行了光照与清洗，细胞处于适应期，故存在一定的钙振荡，测得的[Ca]i为60~120nml/L，均值约为80nml/L。由文献[4]得知，正常细胞内[Ca ]i为50~150nml/L，可见本系统测量结果基本准确。经历约90s后测量值稳定在80nml/L左右，持续至加入高K 刺激液方才改变，证明系统输出特性相当稳定。加入高K 刺激液后，[Ca ]i经历短期振荡，迅速升高接近2uml/L。停止加药后，局部高K迅速扩散，因此[Ca ]i随之下降到约200mml/L，随后在这一水平附近震荡。本实验测量了5~8个细胞。其结果是，静息状态下PC12细胞内[Ca]i为80.0±15.0nml/L，高K去极化刺激可使PC12细胞内[Ca]i增加到1.9±0.2uml/L，上升至峰值时间约为20.1s。上述结果与国外文献中使用 TLL Photonics GmbH的同类产品所得出的结论完全一致致5.6]。证明了本系统可以满足生理学研究中检测活体细胞[Ca+]i的需要。 图4 高K*去极化刺激引起[Ca²+]i的快速升高，[Ca²+]使用Ca探针 Fura- 2/ AM测量 Fig 4 High K* depolarization generating ramp[Ca2+]increases， measured [Ca2]i by using a Ca2+ in-dicator， Fura- 2/AM 3结 论 Ca作为细胞内重要的信使物质，调控细胞内许多重要的生理过程。因此，Ca 在细胞信号转导中的作用一直是细胞生物学和生物物理学研究的重点。近20年来，细胞内Ca的荧光测定法得到了快速发展。基于比率荧光法的活细胞钙离子荧光显微检测系统的研制成功，为细胞内[Ca]i的监测提供了新的手段。此系统可以连续输出波长均匀的单色光，故可适应未来各种新型 Ca荧光指示剂，提供更多有关 Ca 信号的必要信息；同时此系统对荧光信号的灵敏度高，输出信号的信噪比高，有助于更清晰的采集、分析钙离子探针的荧光信号。借助此系统，可以实时、无损伤的研究细胞内[Ca ]i浓度的变化情况，有助于研究者更深入的研究和了解钙离子在细胞内的动态变化过程和生物调控机制，弄清各信号系统之间的相互关系，找出细胞内不同类型 Ca 是否能引起不同基因表达的原因，从而帮 (上接107页) 化学突触的动态特性进行了模拟，程序结果证实了此模型的合理性，能很好再现突触的易化、压抑、增强，最后恢复到正常水平的变化过程。缺点是：对模型中各个函数的选取比较难以把握，函数选取的好坏将直接决定突触动态特性模拟效果，对于不同的突触应有不同的函数表达式，同时显现了模型的灵活性。本研究模型的完善还需要进一步探讨，需要现代分子生物学对突触的微观解释，如神经递质在不同时刻释放的速率，神经递质的合成速率，胞内Ca的高浓度性如何会导致物理上的变化，一般神经终末的递质数量有多少，随动作电位到来而释放递质的时间一数量曲线等。但是，要建立非常精确的模型很难，除非用 Hodgkin- Huxley 方程描述，但此方程需要了解的参数太多，方程求解也很复杂，只有简化处理才能满足实际应用。 ( 参考文献： ) ( [1]Martic T Hagan ， Howard B D emuth ，Mark H B e ale. N e ural N e twork D e - ) 助生物学家及生理学家总结出Ca1作为胞内第二信使在信号转导中的规律。 ( 参考文献： ) ( [1]卢步峰，黄饴森，鲁友明.用Fura 双波长荧光法测定神经细胞内 游离钙[J]. 生 物化学与生物物理进展，1994，21(3)：275-277. ) ( [2]李海山，王金，朱卫华，等.Fura-2探针对希土 Y3 + 跨PC12细胞膜行为研究[J].无机化学学报，1999，15(1)：83-88. ) ( [3]康华光，等.膜片钳技术及其应用[M].北京：科学出版社，2003. 130- 1 38. ) ( [4]许鑫华，傅英松，韩波，等.荧光标记法检测活细胞内游离钙离子 浓度的改进[J].科技通报，2003，19(4)：282-284. ) ( [5]Takuya Kishimoto， Ting- T i ng Liu， Y asunori Ninomiya， et a l . I on se- lectivities o f t h e Ca + sensors for exocytosis i n r a t phaeochromocytoma cells[J]. Journa l o f Physiology， 20 0 1 ， 533(3)：627-637. ) ( [6]Takahashi A ， Camacho P，Lechleiter J D ， e t al. M e a surement of i n tracel- lular calcium[J]. Physiologica l Rev， 1999 ， ( 7 9)：1089. ) ( [7]邹寿彬，陈良怡，康华光.胞内钙信号系统[J].生命的化学， 2000， 2 0(6) ： 254-257. ) ( (收稿日期：2004-03-19) ) ( sign[M].PWS Publishing Company，1996.1-4 2 2. ) ( [2]阎平凡，张秋水.人工神经网络与模拟进化计算[M].北京：清华大学出版社，2000.1-290. ) ( [3]Aihara K， Ta k abe T， T o y oda. Ch a otic neural net w orks[J]. 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