生物制品中有效成分含量分析检测方案

·737·中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2006，37(11) >>>>>>>>> 药物制剂 Skkkkkkkkk< PEG化聚乙烯亚胺作为非病毒基因给药载体的研究 蔡 佳，陈 钧，黄 平， 申云帆，蒋新国* (复旦大学药学院药剂学教研室，上海200032) 摘要：采用不同比例的单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基丙酸盐(mPEG-SPA)对支链聚乙烯亚胺(PEI)进行修饰，考察了不同接枝率的mPEG-PEI与DNA复合物的粒径、电位、包封率，及其对A549细胞的转染效率和细胞毒性。体外转染试验表明，低PEG接枝率的PEI转染效果与PEI相当，且细胞毒性大大降低。 关键词：聚乙烯亚胺；聚乙二醇修饰；非病毒载体 中图分类类：R943 文献标识码：A 文章编号：1001-8255(2006)11-0737-05 1995年Boussif等首先报道了聚乙烯亚胺(polyethylenimine， PEI)可作为非病毒载体。相对于其它载体，PEI价格低廉、体内外转染效果较高。PEI单体中含两个碳原子和一个氮原子，因此分枝状的PEI分子中可含有伯胺、仲胺和叔胺，且每一个氨基都能质子化。带正电的氨基基团能与DNA分子中带负电的磷酸基团相互作用，所形成的纳米级复合物能被细胞内吞。该复合物的转染效率是基于PEI有较强的结合和压缩DNA能力，能使DNA逃脱内体(endosome)的吞噬，免受核酸酶降解。但PEI作为基因递释载体还存在一定缺陷，首先是细胞毒性问题，在转染细胞时须谨慎调节PEI与DNA的比例。其次， PEI-DNA复合物的溶解性较差，采用常规方法无法制备稳定的PEI-DNA给药系统。近年研究表明，对PEI进行聚乙二醇(PEG)修饰可提高PEI-DNA的溶解性；屏蔽复合物表面的正电荷，减小细胞毒性；延长体内循环时间13~7。但也有实验表明， PEI在PEG化后转染效率极大降低，如Kichler等8.报道高度PEG化的PEI(每个PEI分子接枝50个PEG)毒性低，溶解度较高，但体外转染效率仅为原来的1/10。由此推断对PEI进 ( 收稿日期：20 0 6-04-26 ) ( 作者简介： 蔡 佳( 1 980)，女，硕士 研 究 生 ， 专 业 方 向： 非 病 毒载 体的设计。 ) ( 通讯联系人：蒋 新 国 ( 1947)，男 ，博 士 生 导 师，从事药物靶向递释系统研 究 。 ) ( Tel：021-54237381 ) ( E-mail： xgjiang@shmu.edu.cn ) 行适度的PEG修饰可能在不显著降低转染效率的前提下提高PEI-DNA复合物的物理稳定性，降低细胞毒性。本试验初步考察了PEI的PEG接枝率对其作为基因递释载体的影响。 仪器与材料 UV-2401 PC型紫外分光光度仪(日本岛津)；380 ZLS型粒度/zeta电位测定仪(Nicomp公司)；LS 55型荧光光谱仪(PerkinElmer公司)； LB 9507型化学发光检测仪(Berthold公司)； Alpha2-4型冷冻干燥仪(Martin Christ公司)； MercuryPlus 400MHz核磁共振仪(Varian公司)。 A549人肺癌细胞(美国菌种保藏中心)；编码虫荧光素酶基因的质粒pCMV-luc(自行构建)；胎牛血清(FCS)、Dulbecco's Modified Eagle Medium培养基(DMEM)、胰酶(Gibco公司)；虫荧光素酶测定试剂盒、CCLR细胞裂解液(Promega公司)； PicoGreen DNA定量试剂盒(MolecularProbes公司)；BCA蛋白定量试剂盒(上海申能博彩生物有限公司)；单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基丙酸盐(mPEG-SPA， mPEG分子量2000， Nektar公司)；支链PEI(分子量25000， Aldrich公司)； Amicon Ultra-4超滤膜(截留分子量3k和10k， Millipore公司)。 27方法与结果 2.1 不同接枝率mPEG-PEI的制备 PEI(0.25g，0.01mmol)溶于pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)10ml中，共5份，分别缓慢加入不同量的mPEG-SPA(0.01、0.02、0.05、0.1和0.2mmol)，室温搅拌24h。所得聚合物分别称为mPEG-1-PEI(1)， mPEG-2-PEI(2)， mPEG-5-PEI(3)， mPEG-10-PEI(4)和mPEG-20-PEI(5)。 2.2mPEG-PEI的纯化 分别取上述溶液约2ml，各置超滤管中(截留分子量10k)，离心至剩余液体约1ml时补充去离子水4ml，重复5次，以去除反应液中的低分子杂质，剩余液体常规冻干。 2.3mPEG-PEI的分子量及接枝率测定 取“2.2”项下所得各冻干品适量溶于D，O，进行HNMR分析。以聚合物1为例(图1)，通过氢谱对mPEG-PEI各官能团的归属解析如下：化学位移3.4~3.6的峰为mPEG中-O-CH，-CH-单元质子峰；2.4~3.0为PEI中-CH，-CH，-NH-单元质子峰9.，10J 图111的HNMR 图谱 根据氢谱中mPEG和PEI单元质子峰的峰面积，可按下式计算PEI与不同量的mPEG-SPA反应后每个PEI分子的mPEG接枝率(n)及mPEG-PEI数均分子量(M)。结果见表1。 式中， M(mPEG)为2000； M(PEI)为25000； ScH，和SCH，CH，NH分别为mPEG中-O-CH，-CH，-和PEI中-CH，-CH-NH-单元的质子峰的积分面积；44、43和 4、5分别表示上述两个单元的分子量和氢原子数量。 M，(mPEG-PEI)=n×M(mPEG)+M，(PEI) 表1 mPEG-PEI的接枝率和数均分子量 聚合物 投料比 n M 1：1 1.03 27060 2 1：2 2.12 29240 3 1：5 5.37 35740 4 1：10 10.22 45440 5 1：20 20.96 66920 由表1可知，控制mPEG-SPA的投入量能近定量地修饰PEI，说明该制备方法较稳定、可控。 2.4PEI及其衍生物与DNA复合物的制备 参考文献制备PEI或mPEG-PEI与DNA的复合物。N：P(表示PEI与DNA的比例，即PEI的氨基与DNA的磷酸基团的摩尔比)对形成的PEI-DNA复合物性质影响很大。复合物的细胞毒性随N：P增大而增加，但N：P过小时转染效果不佳，所以N∶P一般要进行优选。 DNA、PEI及mPEG-PEI分别用水按所需N∶P配成相应浓度。将适量的PEI、1、2、3、4和5在充分搅拌下逐滴加至等体积的DNA溶液中，室温孵育20min，制成不同N：P的复合物。 2.5复合物的包封率 复合物中未包封的DNA用荧光分光光度法(PicoGreen荧光染料法)测定。PicoGreen是一种可定量测定溶液中双链DNA(dsDNA)含量的超灵敏荧光染料，试剂盒操作手册说明， DNA浓度的线性检测范围可从25pg/ml到1000ng/ml。取试剂盒自带的DNA标准品加水配制成浓度为10、25、50、100、250、500和1000ng/ml的标准溶液，按手册测定荧光强度(激发波长480nm，发射波长520nm)。以荧光强度F对浓度C线性回归，得标准曲线方程F=0.1493C+0.8383， r=0.9997。 取“2.4”项下制得的复合物适量，离心(14000r/min)4h，，K同法测定上清液的荧光强度，由标准曲线计算游游DNA浓度，得到包封率。PEI、 1、2、3、4、5与DNA在不同N：P条件下形成复合物的包封率见表2。 由表2可知， PEI、1、2、3、4、5与DNA分别在N：P为2.5、3、3、4、6和9时几乎完全结合。 2.6复合物的粒径和C电位 采用粒度/zeta电位测定仪，测定上述制得复合物的光散射粒径和叱电位。结果表明复合物粒径为50~300nm。这与多数文献用于体内外转染的复合物粒径范围相近。随着复合物N：P的增加，粒径有减小的趋势，这可能是因为随着PEI量的增加，对DNA的压缩能力增强；未经PEG修饰的PEI/DNA复合物，放置一段时间后粒子会相互聚集。 聚合物 N：P 1 2 2.5 3 4 5 6 9 12 PEI 85.2 98.15 >99.9 >99.9 >99.9 >99.9 >99.9 ≥99.9 ≥99.9 1 80.3 85.6 97.5 ≥99.9 ≥99.9 ≥99.9 ≥99.9 ≥99.9 >99.9 2 76.8 81.4 95.4 >99.9 ≥99.9 ≥99.9 ≥99.9 ≥99.9 ≥99.9 3 64.3 75.1 92.6 97.2 >99.9 ≥99.9 >99.9 >99.9 >99.9 4 45.8 60.7 72.6 83.4 90.3 96.8 ≥99.9 ≥99.9 ≥99.9 5 30.6 42.1 53 62.8 77.8 85.5 93.6 ≥99.9 ≥99.9 同一接枝率的复合物，电位随N：P的增加而增大，是PEI的正电荷增加所致；同一N：P的复合物，《电位随接枝率的增加而减小，说明PEG有较强的屏蔽PEI正电荷的作用。 2.7 虫荧光素酶活性法评价体外细胞转染效率 2.7.1 细胞的培养 A549细胞用DMEM培养液[添加10%(v/v)FCS、10'u/L青霉素、0.1g/L链霉素和2mmol/LL-谷氨酰胺]悬浮，于37℃、5%CO，(饱和湿度)条件下连续培养。每3~4d用0.1%胰酶-0.02%EDTA溶液消化，1：3稀释传代。 2.7.2 细胞的转染 取“2.7.1”项下消化后的A549细胞，均匀接种于24孔板，使细胞汇合度(即细胞铺满培养板的程度)达50%，每孔加DMEM(含10% FCS)1ml。同上培养24h，使A549细胞汇合度达70%~80%。转染前，将介质换为不含血清的DMEM，加入“2.4”项下新鲜制得的复合物(含pCMV-luc质粒2.5ug)100ul。每种复合物平行实验3孔，轻轻摇动24孔板使复合物铺匀，孵育5h后换含10% FCS的DMEM，继续培养31h，弃去培养液，待测。 2.7.3 虫荧光素酶活性测定 取“2.7.2”项下转染36h的细胞，用PBS漂洗2遍，加预冷至0℃的CCLR细胞裂解液100pl覆盖细胞，温和摇动培养液15min，收集裂解液，离心(14000r/min)5min， 收集上清液。取上清液5u1置化学发光测定小杯中，加虫荧光素测定液100ul混匀，用虫荧光素酶分析系统立即测定10s内虫荧光素酶活性的相对白单位(relative light unit， RLU)。另取裂解液25ul，采用BCA法测定裂解液中蛋白总量，以校正由于每孔细胞之间密度不同而导致的虫 荧光素酶表达量的差异，最终以每毫克蛋白的RLU来表示虫荧光素酶的活性。 以PEI-DNA复合物转染效果最佳条件(N∶P为6)下的细胞转染效率为参比，通过STAT软件采用t检验评价各复合物对A549细胞转染效率差异的显著性。结果见图2。 注：与PEI-DNA(N：P为6)相比，*P<0.05、**P<0.01 图2不同PEG化程度和不同N：P条件下形成的复合物对A549细胞的转染效率(n=3) 由图2可见， 1-DNA复合物在N：P为6、9、12，2-DNA在N：P为12时，转染效率与PEI-DNA(N：P为6)无显著性差异(P>0.05)，而其它mPEG修饰的PEI复合物转染效率则显著降低(P<0.01)。 2.8 复合物的细胞毒性 A549细胞接种于24孔板，照“2.7.2”项下操作，转染5h后换含有10%FCS的DMEM，继续培养24h， 弃去培养液，剩余物加无血清DMEM 200pl和0.5%MTT(w/v)50u1(用PBS配制)，37℃孵育4h。翻板法去去培养液，加DMSO 100ul， 振荡10min， 于570nm波长处测定吸收值。以未经转染的细胞同法操作，作为对照，按下式计算细胞相对活力。 细胞活力(%)=样品吸收值/对照吸收值×100%。 以细胞活力表征复合物的毒性，并通过STAT软件的t检验评价A549细胞转染各复合物与PEI- DNA复合物(N∶P为6)后存活率差异的显著性。结果见表3。 表33AA549细胞转染PEI及其衍生物与DNA复合物的细胞存活率(n=3) 聚合物 N：P 6 9 12 24 48 PEI 84.2±1.3 74.1±3.5 66.3±6.51) 1 97.0±1.6” 94.5±1.6” 85.9±1.7 69.2±3.9” 2 98.5±4.4” 94.9±2.4” 90.1±2.9” 76.4±3.5” — 3 98.4±4.8” 92.8±3.3” 87.0±3.3 76.0±5.3 4 101±4.7 97.0±3.3” 91.3±5.1 83.3±2.1 5 - 101.1±7.2” 93.5+4.8 84.2±4.7 注：与PEI-DNA (N：P为6)相比， "P<0.05，2P<0.01 由表3可知， PEI经mPEG修饰后，能屏蔽部分正电荷，降低毒性。随N：P的增加，各复合物的细胞毒性增加。PEI-DNA复合物在N：P为12时即出现较大的毒性。当接枝率为1时， PEI已有较好的降低毒性效果，其复合物在N：P为6和9时的细胞毒性明显减小。2的情况与1类似。3-DNA、4-DNA和5-DNA在各种N：P条件下细胞毒性均较小，这是因为mPEG对PEI的接枝率增加，对PEI正电荷的屏蔽作用增强，使细胞毒性显著减小，但这种屏蔽作用也会导致转染效率降低。 3 讨论 本研究系统考察了不同mPEG接枝率的PEI性质，并通过定量检测虫荧光素酶活性，评价其与DNA形成的复合物对体外细胞转染效果的影响。结果表明， PEG衍生化后， PEI与DNA的结合有不同程度的降低，毒性也减小。复合物的转染效率随mPEG接枝率的增加而降低，但在低接枝率(即每个PEI分子接枝1或2个mPEG)的情况下，调整N：P，仍能得到较理想的转染效率。1-DNA复合物在N：P为9和2-DNA复合物在N∶P为12时的转染效果与PEI-DNA复合物的转染效果相似。PEI经PEG化修饰后，表面负电荷减少，与体液中蛋白的结合也较少，在体内应用可能具有更大优势，是一种有研究应用前景的载体。 ( 参考文献： ) ( [ 1 ] B oussif O， L ezoualc'h F， Z anta M A， e t al. A v ersatile vectorfor gene a nd oligonucleotide transfer into cells in culture andin vivo： polyethylenimine [J] . P roc Natl Acad Sci USA， 19 9 5， ) ( 92(16)：7297-7301. ) ( [2] C hoosakoonkriang S， L o bo BA， Ko e GS， et a l. Bi o physical characterization of PEI/DNA c o mplexes[J] . J Pharm Sci ， 2003，92(8)：1710-1722. ) ( 3] O gris M ， Walker G， Bl e ssing T， et a l . T umor-targeted g e ne therapy： strategies f or t he p reparation o f ligand-polyethylen e glycol-polyethylenimine/DNA complexes [J ] . J C o ntrolled Release，2003，91(1-2)：1 7 3-181. ) ( 41 Wolschek M F ， Thallinger C， Kursa M， et al. Specificsystemic n onviral gene delivery to human h epatocellularcarcinoma xenografts i n SCID mice[J ] . H e patology， 2002， 36(5)：1006-1114. ) ( [5] Ogris M， B runner S， Schuller S， et a l . PEGylate d DNA/transferrin-PEI complexes： reduced i n teraction with b l oodcomponents， extended ci r culation in blood and po t ential fo r systemic gene delivery [ J ]. Gene The r ，1999，6(4)：595-605. ) ( [6] B lessing T ， K ursa M ， Holzhauser R， et al. Different s t rategies for formation of pegylated EGF - conjugated PEI/DNA complexes f o r targeted gene delivery [ J ]. Bioconjug Chem， 2001，12(4)：529-537. ) ( [7] Kursa M ， Walker GF， R o essler V ， et al. Novel shieldedtransferrin-polyethylene glycol-polyethylenimine/DNA complexes for systemic tu m or-targeted gen e transfer[J]. Bioconjug Chem，2003， 14(1)：222-231. ) ( [8] K ichler A， Chillon M， L eborgne C，et al. I ntranasal gene delivery with a polyethylenimine-PEG conjugate [J]. J Controlled Release， 2002，81( 3 )：379-388. ) ( [9] Petersen H ， Fechner P M， Martin AL， et al. Polyethylenimine- graft-poly (ethylene glycol) copolymers： i n fluence o f copolymer block structure on DNA complexation and biological activities as gene delivery system[J] . B ioconjug Chem， 2002，13(4)：845-854. ) 豆腐果素缓释微丸包衣工艺的研究 卢文芸，陆伟根* (上海医药工业研究院，上海200437) 摘要：分别以Surelease、Eudragit RS 30D/RL 30D为包衣材料，制备豆腐果素缓释微丸，筛选包衣工艺的优化参数。结果表明， 用Surelease、Eudragit两种包衣材料均可得到在12h内缓慢释放的微丸，后者有近1h的时滞。 关键词：豆腐果素；缓释微丸； Surelease； Eudragit RS 30D/RL 30D 中图分类号：R944.9 文献标识码：A 文章编号：1001-8255(2006)11-0741-04 豆腐果素(helicidum， 1，又名神衰果素)系从山龙眼科植物萝卜树(Helicid essatiaHook)果中提取的有效成分，化学名为苯甲醛-O-β-D-阿洛吡喃糖苷，结构与天麻素相似，镇静、安眠、止痛作用较天麻素强。临床用于治疗神经衰弱综合征、血管性头痛、三叉神经痛等，特别对神经衰弱引起的头痛、头昏、睡眠障碍显效较快。目前市售品种仅为普通片剂(商品名：理神，营口奥达制药有限公司)，每日服用3~4次。本研究制备了1缓释制剂，以期达到减少给药次数、提高患者依从性的目的。 ( 收稿日期：20 0 6-02-24；修回日期：20 0 6-08-25 ) ( 作者简介：卢文芸(1980)，女，硕士 ， 从 事 缓控释给药系统研究。 ) ( 通讯联系人：陆伟根(1965)，男 ，研 究员，从 事 新 型 给药系统及其产业化研究。 ) ( Tel： 021-55514600×108 ) ( E-mail： luwg@sipi.com.cn ) 聚合物水分散体包衣技术(aqueous polymericcoating technique)是20世纪70年代初发展的微丸包衣技术，现已逐渐成熟。目前常用的水性包衣材料有乙基纤维素(EC)、丙烯酸树脂、乙酸纤维素(CA)、硅酮弹性体等水分散体。本试验以1为模型药物，分别采用EC水分散体(Surelease)、丙烯酸树脂水分散体(Eudragit RS 30D/RL 30D)为包衣材料，制备缓释微丸，比较两种包衣材料的性能。 1 仪器与材料 Mini Glatt型流化床(德国Glatt)； ZRS-4型智能溶出度仪(天津大学无线电厂)；UV-240紫外分光光度计(日本岛津)。 1 (云南玉溪万方天然药物有限公司，含量97%，批号040301)；空白丸芯(法国爱的发公司，710~850um)；羟丙甲纤维素(HPMC，黏度6mPas，日本信越)； Surelease ( [ 10] PPetersen H， F echner PM， Fischer D， et al. Synthesis，characterization， a nd biocompatibility of polyethylenimine- ) ( graft-poly(ethylene glycol) b lock c opolymers [ J ] . ) ( Macromolecules，2002， 35(18)：6867-6874. ) PEGylated-polyethylenimine as the Carrier of Non-viral Gene Delivery System CAI Jia， CHEN Jun， HUANG Ping， SHEN Yun-Fan， JIANG Xin-Guo* (Dept. of Pharmaceutics， School of Pharmacy， Fudan University， Shanghai 200032) ABSTRACT： The branched polyethylenimine (PEI) was modified with different ratios of mPEG-succinimidylpropionate (mPEG-SPA). The characteristics of complexes of mPEG-PEI and DNA were determined， such as size，zeta potential， entrapment efficiency， the in vitro transfecting efficacy and toxicity on A549 cells. It was found that thetransfecting effect of PEI with lower modified PEG was as efficient as PEI itself， whereas their toxicity was reducedsignificantly. Key Words： polyethylenimine； PEGylation； non-viral gene delivery system ◎hina Academic Journal Electronic Publishing House. 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