化学药中特殊物质和基团检测方案

[应用纪要]THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. [应用纪要] Waters 使用复合模式固相萃取技术去除血浆样品中的聚乙二醇400 (PEG 400) Jonathan P. Danaceau， Erin Chambers， and Kenneth J. Fountain 沃特世公司，美国马萨诸塞州米尔福德 应用优势 去除血浆中的PEG 400 去除PEG 400的离子抑制乍用 只需快速、简单的样品前处理方法即可实现净化目的 沃特世解决方案 OasisMCX 96孔板ACQUITY UPLCBEHC柱 关键词 赋形剂去除， PEG去除， SPE， LC/MS， ESI，离子抑制，基质效应 引言 PEG 400等药物赋形剂通常被加入到制剂中以促进其在介质中溶解。然而，这些化合物却可引发显著的基质效应，尤其是在LC/MS/MS分析中产生的离子抑制效应。常规药物研发流程中使用的快速LC梯度方法，容易导致此类化合物和目标分析物的共流出。由于这种共流出物已被证实是导致离子抑制效应的主主原因，因此在早期药代动力学(PK) 研究中，赋形剂浓度偏高可能会带来棘手的问题。为尽量减少这一问题引发的不良影响，目前已研究出的方法包括：LC梯度调节2，分析色谱柱的选择'，样品制备策略的方法开发1-3，样品稀释，甚至是全新制剂药的开发^。即便其中部分方法已取得成效，他们也存在各自的局限性。很显然，分析员通常无法自己选择制剂药赋形剂。无论是改变梯度或流动相，还是色谱柱的选择，LC条件的优化都能够针对部分分析物解决这一问题，但它既无法应用到全部分析物，也需要更多的方法开发作为辅助支持。同时，对LC运行条件的过多优化并不利于高通量分析。有研究人员指出，!，"若能开发出一种更优化的固相萃取 (SPE)方法，便可实现有效的净化效果。”3 针对以上问题，本应用纪要通过使用Oasis复合模式阳离子交换(MCX)SPE方法提供一一种可以快速、便捷、高效的解决方案。碱性分析物通过强阳离子交換作用被吸附在填料中，而如PEG等非离子型的赋形剂则通过反相机理被吸附，同时能够在分析物洗脱之前被选择性去除。 实验 样品制备 标准品包含：醋丁洛尔、美托洛尔、拉贝洛尔、咪达挫仑。这些成分分别加入到空白血浆中、调整其浓度至200 ng/mL，或是后加标到萃取后的空白血浆洗脱液中，用于回收率的计算。PEG400也是分别加入到空白血浆中调整其浓度到到5 mg/mL或者后加标到萃取后的空白血浆洗脱液中用于确定回收率。 样品按照OasisMCX的标准操作流程进行萃取。简单来说，在0.5mL兔血浆中加入0.5 mL4%HPO进行酸化。(注意：本研究中采用的是0.5mL血浆，采用更小剂量亦可)。MCX96孔板在经过1.0mL MeOH和1.0mL Hz0活化平衡之后，经酸化的样品被上样到填料中.上样后，使用1.0mL 2%甲酸和2×1.0 mL MeOH清洗。样品使用2×250pL含5% NHOH的MeOH溶液进行洗脱。“后加标”(PS)样品是在空白兔血浆洗脱液中加入标准品或标准品与PEG 400的混合物。经萃取的样品则以以下方式制备：在未经萃取的血浆中加入200 ng/mL标准品、或在其基础上再加入5mg/mL PEG 400。 PEG去除的回收率依据以下算式得出： %回收率=(萃取样品峰面积/后加标样品峰面积)×100% 为进行PEG去除的相关分析，样品按照1：200的比例在流动相中进行稀释，以避免高浓度PEG 400给质谱仪带来的污染。 方法条件 SPE条件 SPE板： Oasis MCX 96孔板30 pm(30mg)，部件编号：186000248 液相色谱条件 液相色谱系统： 沃特世ACQUITY UPLC系统 检测： 沃特世ACQUITYSQD样品瓶： 2mL96孔收集板；部件号 WAT058958 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH Cj： 1.7 pm， 2.1x50 mm， 部件号：186002350 柱温： 30℃ 样品温度： 10℃ 进样量： 10pl 流速： 0.5 mL/min. 流动相A(MPA)： 0.1%HCOOH水 流动相B(MPB)： 0.1%HCOOH乙腈 初始流动相条件为95：5 MPA：MPB。持续0.5分钟，MPB在2.5分钟之后增至90%。MPB比例随后降回5%，并持续2分钟，重新平衡色谱柱。总运行时间5.0分钟。 质谱条件 质谱系统： 沃特世ACQUITY SQD 电离模式： (+) ESI 采集范围： SIR 毛细管电压： 2.5 kV 锥孔电压： 根据化合物有所区别(针对不同分析物进行优化)脱溶剂气体： 700L/min 锥孔气： O L/min 数据管理 色谱系统： MassLynxV4.1 SCN714和MS软件 结果与讨论 PEG 400及其他四种测试化合物的色谱图如图1所示。图中宽峰是PEG400丰度较大的分子离子峰的综合TIC， 包括以下分子量的PEG单峰：370、414、458、502、546、590和634。标准品(醋丁洛尔、美托洛尔、拉贝洛尔、咪达挫仑)可通过MH+离子的SIR显示，除咪达挫仑，它的MH+离子与(MH-35)*离子合并成一个峰。值得注意的是，醋丁洛尔和美托洛尔均与PEG发生共流出，因而二者更容易受到血浆样品中残留PEG产生的离子抑制的影响。图2为PEG的两个色谱图。A图显示未经过SPE处理的血浆样品中PEG含量情况。它是将PEG后加标至萃取的最终血浆洗脱液中得到的。B图则为含有5 mg/mL PEG的血浆样品经标准MCX流程萃取得到的，该图表明血浆样品中几乎全部PEG400都得以去除。图3显示为实验所用样品组的平均PEG峰面积，如图所示，采用MCX萃取，超过99%的PEG400得以去除。 图1.PEG 400及标准品色谱图 图2.5 mg/mL PEG 400-后加标色谱图和加标样品萃取色谱图 图3.使用MCX从血浆中去除PEG 按照前文方法的方程式计算分析物回收率。如图4A所示，采用标准MCX流程后，每种分析物的回收率都超过80%。而对这四种分析物而言，平均回收率则达到95%。如图4B所示，血浆中含有的5 mg/mL PEG 400对于分析物回收率并无影响。在含有PEG的情况下，平均回收率为103.6%。 图4A.血浆样品中的分析物回收率 图4B.含PEG血浆样品的分析物回收率 将PEG 400从血浆中去除的主要目的就是为了清除可能引发的离子抑制效应。图5为由下面方程式得出的基质效应数据一览，据最新AAPS论文报道。 图5.萃取样品中的基质效应(MF) 基质效应=(含PEG的峰响应值/不含PEG的峰响应值) 图表A所示数据来源于经Oasis MCX萃取去除PEG的血浆样品。图表B所示数据来源于经萃取后又加入PEG的血浆样品，1可以看到在样品制备过程中未去除PEG的结果。由图显示，若未去除PEG，醋丁洛尔和美托洛尔受到严重的离子抑制作用影响，基质效应因子分别为0.45和0.77。由上述数据可以清晰看出，那些与PEG峰共流出的分析物，使用Oasis MCX SPE板去除PEG后，离子抑制效应能得以有效清除。经PEG去除后，最终醋丁洛尔和美托洛尔的基质效应因子分别为0.93和1.04。 Oasis MCX 96孔板提供了一种用于去除血浆样品中高浓度PEG的简便、快捷、高效的方法，从而消除早期药代动力学研究中常见的基质效应(通常是离子抑制效应)。此外，该解决方案无需进行色谱分析方法的再开发、样品的稀释、及其他费时费力的流程即可成功解决上述问题，这使得整个解决方案广泛适用于高通量分析的应用。 ( 参考文献 ) ( 1 . T ong X ， Wang J， Zheng S， Pivnichny J， G riffin P， Shen X， Donnelly M， V akerich K， Nunes C， a nd Fenyk-Melody J. Effect of s ignal i nterference f rom dosing excipients o n pharmacokinetic screening of drug candidates b y l iquid chromatography/mass spectrometry. A n al Chem 2002 74：6305-6313. ) ( 2 . W eaver R and Riley R. Identification and r eduction of i on suppression e ffects on pharmacokinetic parameters by polyethylene glycol 4 00.Rapid Comm Mass Spec 2006 20：2559-2564. ) ( 3 . S hou W and Naidong W. Po s t-column infusion stude of the ‘ d osingvehicle effect’in the liqui d chromatography/tandem mass s pectrometric analysis o f d iscovery pharmacokinetic s a mples. R a pid Comm. M ass Spec 2003 17：589-597. ) ( 4. T T emesi D ， Law B， and Howe N . Synthesis and evaluation o f PEG414，a novel f ormulating a g ent that a v oids analytical problems as s ociatedwith polydispersive vehicles such a s PEG400. J. Ph a rmaceutical Sciences 2003 92(12)：2512-2518. ) 5. Larger P， Breda M， Fraier D， Hughes H， and James C. lon-suppressioneffects in liquid chromatography-tandem mass spectrometry due toa formulation agent， a case study in drug discovery bioanalysis. J.Pharm. Biomed. Anal. 2005 39：206-216. 6. Bansal S and DeStefano A. Key elements of bioanalytical methoddevelopment validation for small molecules. The AAPS Journal 20079(1)：E109-E114. THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 沃特斯中国有限公司沃特世科技(上海)有限公司 Waters、 The Science of What’s Possible、Oasis、ACQUITYUPLC、ACQUITY和MassLynx是沃特世公司的注册商标。其他所有商标均归各自的拥有者所有。 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28296555 成：028-65545999 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400)820 2676www.waters.com 使用复合模式固相萃取技术去除血浆样品中的聚乙醇(PEG