聚乙烯亚胺转染人神经母细胞瘤细胞效果的影响因素

广东医学 2013年6月第34卷第12期 Guangdong Medical Journal Jun. 2013， Vol. 34， No. 12·1801· Guangdong Medical Journal Jun. 2013， Vol. 34， No. 12广东医学2013年6月第34卷第12期·1802· 本刊编辑部 聚乙烯亚胺转染人神经母细胞瘤细胞效果的影响因素* 解龙昌，张珊珊，黄莉，龙友明，高聪^ 广州医学院第二附属医院神经内科(广州510260) 【要】 目的 探讨聚乙烯亚胺(PEI)转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)效果的影响因素。方法 利用电泳阻滞实验测定 PEI 与 DNA形成复合物时所需的比例，通过 MTT 法测定 PEI 对 SH-SY5Y 细胞的毒性，采用流式细胞术检测细胞转染效率，探索转基因次数对 PEI 转基因效率的影响。结果 PEI 完全结合 DNA 的N/P比为≥3。PEI 转基因时，PEI终浓度应≤7 ug/mL。在N/P=9时，转染细胞阳性比例较高。增加转染次数不能提高转染效率。结论 PEI 是有效的体外真核细胞转染剂，可作为 SH-SY5Y 的基因载体。 【关键词】 聚乙烯亚胺；人神经母细胞瘤细胞；基因载体 Identificatify the influencing factors on polyethylenimine transfection efficiency.. XIE Long -chang， ZHANG Shan-shan， HUANG Li， LONG You -ming，GAO Cong. Department of Neurology， The Second Affiliated Hospital of GuangzhouMedical University， Guangzhou 510260， China Corresponding author： GAO Cong， E-mail： gaocong2@yahoo. com. cn Abstract】 Objective To investigate the feasibility of polyethylenimine (PEI) as gene vector of SH -SY5Ycells.MethodsThe electrophoretic retardation test was carried out to find the suitable N/P ratio for complex formation ofPEI and DNA. The cytotoxicity of the nanoparticles was assessed by MTT methods. The transfection efficiency was evalua-ted by flow cytometry. ResultsGel electrophoresis retardation assays showed that PEI completely retarded DNA migrationwith N/P≥3. MTT test show that the toxicity of the PEI with concentration lower than 7 ug/mL provided low toxicity. Thetransfection efficiency was highest with N/P of 9. The increase of transfection time provided no improvement in transfectionefficiency. Conclusion PEI is an efficient gene transfection agent of eukaryotes in vitro， and could be used for gene vec-tor of SH -SY5Y cell. 【Key words】 polyethylenimine； SH-SY5Y cell； gene vector 神经系统疾病的治疗方法主要分为细胞移植治疗、药物治疗和基因治疗。基因治疗中最关键的是将DNA转入细胞之中，进而进入细胞核。所以需选用适当的载体转运才能被靶细胞摄取。目前应用于基因治疗研究的基因转移载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类”。非病毒载体大多制作简单，免疫原性低，不与宿主基因整合，可重复应用，克隆能力不受限，而其中的脂质体和纳米载体聚乙烯亚胺(polyethyleni-mine，PEI)是阳离子高聚物的典型代表，目前已经成为新型非病毒载体中研究的热点12-3]。但人类神经元细胞和原代的神经细胞很难转染，转染试剂对培养基和血清的敏感性以及细胞毒性经常导致低转染率、低细胞低存活率和神经退行性变化4-5]，因此常选择肿瘤细胞系进行实验研究。2012年110月，本研究探讨 PEI在神经系统常用细胞神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中的转染效果，测定多种因素对转染率的影响，以筛选出 ( *广东省自然科学基金资助项目(编号：S2011010002975)，广东省 科技计划项目(编号：2012B031800240) ) ( ▲通信作者。E -mail：gaocong2@ yahoo. com. cn ) 适合神经系统常用细胞的基因治疗载体，为基因技术在神经系统常用细胞中的应用研究提供指导。 材料与方法 1.1 实验试剂 PEI购自BASF公司。高糖 DMEM 细胞培养基、胎牛血清和胰蛋白酶均购自加拿大 Gibco公司。质粒小提试剂盒购自日本 BioFlux 公司。胰蛋白胨和酵母提取物购自英国OXOID 公司。人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y均购自中国科学院广州分院保藏中心。 1.2 质粒 DNA(pDNA)的制备 质粒在大肠杆菌中扩增，然后用 BioFlux 的质粒提取试剂盒提取纯化。得至的质粒通过紫外分光光度计(NanoDrop，ND -1000Spectrophotometer，V3.2)在260 nm 和280 nm 波长处检测其纯度(A260/A280)和浓度(A260)。然后在1.0%的琼脂糖凝胶上以100V电压电泳40 min，检测其完整性。检测合格的质粒保存于-20℃保存备用。 1.3 细胞培养 将人神经母细胞瘤株 SH-SY5Y细胞置于10%胎牛血清 DMEM 完全培养液中，单层培养法传代培养生长至所需的细胞数。在细胞于对数生长 期大约80%时，以0.25%胰酶消化，收集消化液离心后去除上清液，Hanks 液吹打冲洗2次后以 Hanks 液制成细胞悬液，调节细胞浓度为1×10. uLHanks 液，置于37℃水浴待接种。台盼蓝排斥实验检测细胞活力>95%。 1.4 纳米材料/pDNA复合物的制备 取5 mg 的PEI，用高压灭菌后的去离子水5 mL 溶解稀释纳米粒子，配制成终浓度为1 mg/mL 的纳米粒子溶液，用0.22 um 针头滤器过滤后4℃保存备用。在 Eppendorf管中，将1 pg pDNA 稀释在 50 p.L 不含 FBS 和抗生素的 DMEM中，振荡均匀；按不同 N/P 比把相应量的纳米材料加加到另外一管装有 50 u.L不含 FBS 和抗生素的 DMEM 的 Eppendorf 管中混匀，静置约5 min 后把两溶液混合，在室温下用漩涡振荡器低速振荡5 min 得到均匀复合物，37℃静置 30 min 以保证 pDNA与纳米粒的充分结合。 1.5 琼脂糖凝胶电泳观测纳米粒与质粒的结合能力 纳米粒子溶液与 pDNA 按 N/P比为0、1、3、5、10、20、30和40漩涡振荡混匀后，室温静置30 min。上样前与6倍的琼脂糖染色剂 Loading buffer 混合，终体积10~20 p.L，上样到含有 EtBr(0.1pg/mL)的1.0%琼脂糖胶板上，在PBS 中以100V的电压泳动40 min，通过紫外灯观测 DNA 的迁移情况并摄片记录。 1.6 MTT 比色法检测细胞毒性 PEI 置于无血清的DMEM 培养基中配置，浓度梯度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 ug/mL。作用前24 h，所有细胞以1×10*个/孔的密度种植在96孔板内。24h 后，细胞获得75%~85%的融合度。立即去掉原有培养基，用 PBS 洗涤1遍，每孔加入含有200 ng pDNA 的纳米材料/pDNA的复合物150 u.L不含血清培养液进行转染，每个 N/P浓度复制在5个孔中，同时设调零孔、对照孔和实验孔。作用24h或48 h后加加20 u.L 新鲜配制的 MTT 溶液(5 mg/mL)继续培养4h，小心吸出孔内上层清液后，每孔加人100 pL DMSO，室温避光低速震荡约10 min 后，通过化学发光酶标仪测定在570 nm 处的吸光值(OD值)生存率计算比较对照孔细胞(100%存活)。 1.7 不同 N/P 比转染细胞效率的差异 配制 PEI/DNA混合物，每1 ug质粒稀释在25 pL PBS 中，对应量的 PEI 也稀释在等体积的 PBS 中。然后将 PEI 溶液与质粒溶液混合均匀，于室温温育30 min 后加入无血清的 DMEM，6孔板每孔 PEI/DNA 复合物终体积1mL。取对数生长期 SH-SY5Y 细胞接种在96孔板中，转染入 pEGFP 质粒，按一定的 N/P 比把相应量的纳米材料和 pEGFP 质粒混合在一起。加入200 p.L 无血清的 DMEM，混合均匀。转基因前吸去旧培养液。将PEI/pEGFP DNA 复合物加入到细胞上，水平摇床缓慢 摇动10 min，转入培养箱温育4h后，每孔加入等量体积的含20% FBS 的细胞培养液，培养24~36h后消化细胞。采用流式细胞术检测转染效率。 1.8 转基因次数对转基因效率的影响 SH-SY5Y细胞接种于6孔板上，每孔2.5×10°个细胞，待细胞丰度70%左右时进行转基因实验。每孔转染 4pg的pEGFP 质粒，PEI/DNA 的 N/P比=9，每孔1mL的转染体积。转染前吸去旧培养液，加入转染复合物后培养箱温育2h。温育后不洗涤，每孔加入1 mL 含20%FCS 的 DMEM 培养液，培养12h 后，吸去培养液，重复转染1~2次。1次、2次、3次转染各设一式两份。 1.9 统计学方法 所有实验均重复3次，所有数据以x±s表示，应用 SPSS 13.0统计软件，计量资料采用方差分析。 2 结果 2.1 阻滞实验 本研究表明 PEI 完全结合 DNA，需要N/P比≥3，在这种比例以上，电泳时的电场不能将含负电荷的 DNA 和正电荷的PEI 分开。PEI与质粒DNA 完全结合后，可阻碍溴化乙锭插插DNA 双链中，紫外线灯下看不到 DNA 发出的荧光，见图1。 图1 不同N/P比例下 PEI/DNA复合物凝胶阻滞实验结果 2.2 细胞毒性试验 浓度为1~10 pg/mL的 PEI 作用于 SH-SY5Y细胞24h 后，细胞生存率分别为(65.240±2.301)%、(67.894±2.453)%、(71.579±1.925)%、(76.012±1.820)%、(72.357±2.689)%、(60.387±1.879)%、(57.691±1.658)%、(39.871±2.687)%、(35.029±2.657)%和(19.587±1.943)%。2.3 不同 N/P比转染细胞效率差异 N/P比为3、4、5、6、7、8、9、10、11和12时的细胞生存率分别为(2.349±0.986)%、(3.338±1.039)%、(4.596±1.967)%、(9.800±2.138)%、(10.037±1.348)%、(15.026±1.674)%、(17.145±2.347)%、(16.465±1.967)%(8.328±1.675)%和(5.567±1.764)%。PEI 对于SH-SY5Y细胞在N/P=8~10范围内，转染细胞生存率较高。在N/P=9 时转染效率最高，在N/P=11 以后细胞生存率开始下降。 2.4 转基因次数对转基因效率的影响 PEI/DNA转 基因3次(间隔12h)的细胞生存率分别为(14.538±1.438)%、(15.514±2.046)%和(16.764±2.307)%，组间比较差异无统计学意义(P=0.232)。 3计讨论 基因治疗是指将外源基因转入细胞内部，通过恢复或增添基因表达以纠正人自身基因的结构或功能上的错乱，阻止病变的进展，杀灭病变的细胞，或抑制外源病原体遗传物质的复制，从而达到治疗的目的。基因治疗中最关键的是将 DNA 转入细胞之中，然后进入细胞核。因为质粒 DNA 表面带负电，而细胞膜表面也带负电荷，两者相互排斥，形成胞外屏障，所以需选用适当的载体转运才能被靶细胞摄取。当 DNA 穿过细胞膜后，心须在被体酶降解之前被释放，然后进入细胞核，后一步主要取决于载体本核靶向性。PEI是一有机大分子，正电荷密度高，是将DNA和RNA 引入神经元的极高效的载体。本研究表明 PEI 完全结合DNA，需要N/P比≥3，在这种比例以上，电泳时的电场不能将含含电荷的DNA 和正电荷的 PEI 分开，这与以往研究接近[7-9] PEI对细胞有正电荷相关的毒性，而本研究显示当 PEI培养液浓度>7 ug/mL时细胞死亡增加。PEI的细胞毒性主要与 PEI 的浓度有关， PEI 的细胞毒性是由于其对细胞膜有较高的亲合黏附所致，PEI 在细胞膜上可形成2~6 u.m的团片状物。在光学显微镜下(100倍以上)，当PEI 浓度 7 ug/mL以上并作用4h以上，明显可见细胞表面黏附许多大小相似的颗粒。因此，在PEI 转基因时，PEI终浓度应≤7 ug/mL， GODBEY 等报道 PEI 转染 DNA时，随N/P比增加，细胞毒性增加，阳性细胞比例也增加，但细胞数量会大量减少，降低总体目的产物的表达量。本研究表明 PEI 对于 SH-SY5Y细胞在N/P=8~10范围内，转染细胞阳性比例较高。在 N/P=9时转染效率最高，在N/P=11以后转染阳性细胞比例开始呈下降趋势。 同时，本研究表明 PEI/DNA 转基因1~3次的阳性细胞分别为比例差异无统计学意义(F=3.588，P=0.071)。多次转染的实验操作繁琐，细胞容易污染，而且细胞数目大量减少，因此通过多次转染来提高转染效率不适宜推荐。 综上所述，PEI是有效的体外真核细胞转染剂，可作为 SH-SY5Y的基因载体。 ( 参考文献 ) ( [1 ] SUK J S ， SU H J， LAI S K， et al . 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Biomaterials， 2001，22(5)：471-480. ) ( (收稿日期：2013-02-15 编辑：朱绍煜) ) 发病率和患病率 1发病率 发病率(incidence rate)表示在一定期间内，一定人群中某病新发生的病例出现的频率，观察时间单位可根据所研究的疾病病种及研究问题的特点决定，通常以年表示。 率=一定期间内某人群中群病新病例数xK.K=100%、1000%c或10000/万。 同时期暴露人口数 2患病率 患病率(prevalence rate)也称现患率或流行率，是指某特定时间内一定人群中某病新旧病例所占比例。患病率可按观察时间的不同分为时点患病率(point prevalence rate)和期间患病率(period prevalence rate)两种。时点患病率较为常用。通常患病率时点在理论上是无长度的，但实际调查或检查时一般不超过1个月。而期间患病率所指的是特定的一段时间，通常多超过1个月，期间患病率实际上等于某一特定期间开始时的时点患病率加上该期间内的发病率。 时占串_某一时点一定人口中现患某病新旧病例数K"，期声间患病_某观察期间一定人口中现患某病的新旧病例数，率该时点人口数(被观察人数) 同期的平均人口数(被观察人数) K，K=100%、1000%或 10 000/万。