LC-MS/MS法测定血浆中利拉鲁肽的浓度

使用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪LCMS-8050，建立了血浆中利拉鲁肽测定方法。该方法采用内标法定量，在1.00~200.00 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数为0.9993；定量下限以及低、中、高浓度质控品测定准确度结果与理论值接近，回收率在95.5%~99.8%之间，RSD在2.91%~9.60%之间。该方法操作简单且灵敏可靠，可供相关行业人员参考使用。SSL-CA23-204 Excellence in ScienceLCMSMS-783 LC-MS/MS 法测定血浆中利拉鲁肽的浓度 LCMSMS-783 摘要：本文使用岛津超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪，建立了血浆中利拉鲁肽测定方法，对方法的线性 范围、准确度及精密度进行了考察。结果显示该方法线性良好，质控品测定准确度结果与理论值接近，该方法前 处理简便、分析速度快、灵敏度高，可用于血浆中利拉鲁肽含量测定。 关键词：三重四极杆液质联用仪利拉鲁肽 血浆 技术特点： 必前处理简便快速，仅需简单蛋白沉淀即可上机分析。 心血浆中内源性干扰物与目标物在 Shim-pack GISS-HP 色谱柱上分离良好。 利拉鲁肽 (Liraglutide) 是一种人体内源性物质胰高 血糖素样肽-1 (GLP-1)的结构类似物，能够结合并激 活 GLP-1受体一，，以葡萄糖浓度依赖的方式促进胰岛素 的分泌，抑制胰高血糖素释放，此外利拉鲁肽还可减缓 胃排空，减少能量摄入而发挥减肥作用。虽然利拉鲁肽 在临床使用较广，但该物质定量检测方法的发展却相对 滞后。传统的免疫学方法自开发以来因其操作简单、快 速，在普通实验室即可操作而应用广泛。然而当待测物 分子量相对较小时，免疫学方法的特异性就会因交叉反 应等原因变差。免疫学方法一次实验只能检测一种化合 物，如果联合用药，一一个样本则需要进行多次实验。目 前，国内外越来越多的实验室采用LC-MS/MS方法替代 免疫学方法开展血药浓度检测。 本文使用串联质谱 LCMS-8050， 建立了血浆中利 拉鲁肽测定方法，该方法前处理简便，分析速度快，灵 敏度高，专属性强，可供相关检测人员参考。 ■实验部分 1.1仪器 本实验使用串联质谱 LCMS-8050联用系统。具体配置为： 系统控制器 SCL-40 输液泵灵：：LC-40B X3自动进样器SIL-40C X3柱温箱CTO-40C 仪：色谱工作站： 质 谱 LCMS-8050 ：LabSolutions Ver. 5.120 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱 柱： Shim-pack GISS-HP C18 Metal free column (100 mm x2.1 mml.D.， 1.9 um)；岛津聿(上海)实验器材有限公司， P/N： 227-30922-02 流动 相： A 相-0.1%甲酸水溶液，B相-乙腈 流 柱 速 0.3 mL/min 清洗模式：：清洗泵>清洗口 温50℃： 进样体积 20pL 清洗泵溶液：乙腈/异丙醇/DMSO/水/甲 酸=30：35：10：24.5：0.5 洗脱方式： 梯度洗脱，B相起始浓度为 30%，时间程序如表1所示。 清洗口溶液： 甲醇/水=1：1 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.00 泵 B.Conc 30 2.00 泵 B.Conc 45 5.00 泵 B.Conc 60 5.10 泵 B.Conc 95 6.00 泵 B.Conc 95 6.10 泵 B.Conc 30 10.00 控制器 Stop 质谱条件 离子化模式： ESI+ 雾化气流速： 3.0 L/min 接妥口电压： 4.5 kV 干燥气流速束： 5.0L/min 接口温度： 250°℃ 加热气流速： 15.0 L/min DL温 度： 200°℃ 碰 撞 气： 氩气 加热模块温度：500°℃ 扫描模式：：多反应监测(MRM) MRM参 数： 见表2 表2 MRM 参数 名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) 利拉鲁肽 938.5 1128.6* -34 -31 -40 1064.0 -34 -29 -38 格列苯脲(内标) 494.1 369.1 -34 -34 -36 注：*为定量离子 1.3校准品及样品制备 标准样品：精密称取利拉鲁肽适量，用50%乙腈溶解配制成1mg/mL储备液。用空白血浆溶液稀释成浓度 为200、100、50、20、10、5、2、1ng/mL的系列标准样品溶液； 内标溶液：精密称取格列苯脲适量，用甲醇溶解配制为 1 mg/mL 储备液。用甲醇溶液稀释为 200 ng/mL内 标溶液。 样品制备：取200 uL标准样品或血浆样本，加入20 uL 内标溶液及 400 uL 乙腈(含1%甲酸)，涡旋混匀 3 min， 12000 rpm 离心10 min， 吸取上清液上机测定。 结果讨论 2.1 MRM 色谱图 图1 校准曲线最低点色谱图 2.2校准曲线 对标准曲线溶液按1.2中的分析条件进行分析，内标法制作校准曲线。校准曲线结果见图2及表3，利拉鲁肽 在校准曲线浓度范围内线性良好，相关系数为0.9993， 准确度在94.7%~104.7%之间。 图2 校准曲线图谱 表3 校准曲线信息 名称 线性方程 线性范围(ng/mL) 相关系数 准确度(%) 利拉鲁肽 Y=(0.666501)X+(-0.00338043) 1.00~200.00 0.9993 94.7%~104.7% 2.3准确度及精密度测定结果 按1.3中的前处理方法对定量下限以及低、中、高浓度质控品进行前处理，每个浓度重复制备6份，按1.2中 的分析条件对定量下限以及低、中、高浓度质控品进行分析，准确度及精密度测定结果如表4所示，结果显示测 定结果与理论值接近，回收率在95.5%~99.8% 之间， RSD 在 2.91%~9.60%之间。 表4质控准确度考察结果(n=6，浓度单位ng/mL) 化合物 项目 LLOQ LQC MQC HQC 利拉鲁肽 理论浓度 1.00 2.50 15.00 150.00 测定浓度 0.97 2.39 14.97 143.41 回收率% 96.9 95.5 99.8 95.6 RSD% 9.60 7.59 9.02 2.91 结论 使用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪LCMS-8050， 建立了血浆中利拉鲁肽测定方法。该方法采用内标 法定量，在1.00~200.00 ng/mL 范围内线性关系良好，相关系数为 0.9993；定量下限以及低、中、高浓度质控品 测定准确度结果与理论值接近，回收率在95.5%~99.8%之间， RSD 在 2.91%~9.60%之间。该方法操作简单且灵 敏可靠二，)可供相关行业人员参考使用。 岛津应用云