分析动物性食品中雌激素类残留量

前言17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮均为雌激素类，常在动物性食品中添加使用。畜禽食用含有激素的饲料后，这些激素会沉积在畜禽的肉和内脏中，人食用含有大量激素的畜禽产品后，常常会出现心动过速、心慌、手颤、头晕、头痛等神经中枢调节紊乱的现象，尤其对高血压、心脏病、糖尿病、甲状腺功能亢进、前列腺肥大患者危险性更大。同时影响生殖系统，导致性发育提前，食用激素含量高的畜禽产品可使体内雌激素增高，可能致使男性乳房女性化发育。一些激素还易引起性发育提前和各种肿瘤，如卵巢肿瘤、肾脏腺肿瘤等。本文参考GB 31658.7-2021《食品安全国家标准 动物性食品中17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌酮残留量的测定 气相色谱-质谱法》，使用气相色谱-质谱联用仪检测猪肉中的17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌酮残留量，通过检出限、精密度和准确度等指标评估仪器性能，证明GCMS 1000满足检测的需要。实验部分样品前处理取试样5 g于50 mL离心管，加醋酸钠缓冲液10 mL，均质1 min，涡旋振荡2 min,加葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶20 uL，50℃酶解2 h，加乙酸乙酯20 mL，涡旋振荡3 min，10000 r/min离心5 min，收集上清液于100 mL鸡心瓶中，残渣中加乙酸乙酯20 mL，重复提取1次，合并上清液，40 ℃平行浓缩仪蒸发至近干，用氢氧化钠溶液6 mL分3次溶解洗涤鸡心瓶，洗液转入50 mL离心管中，加正己烷20 mL，涡旋振荡1 min，10000 r/min离心5 min，收集下层清液，加醋酸铵溶液1mL，用冰醋酸调pH至5.0~5.2，备用。取C18固相萃取柱，依次用甲醇、水各5mL活化。取备用液，过柱，分别用水、甲醇水溶液各5 mL淋洗，抽干，加甲醇5 mL洗脱，收集洗脱液，50 ℃水浴氮气吹干。加乙酸乙酯正己烷溶液5 mL使溶解，备用；取硅胶固相萃取柱，加正己烷5 mL活化，取备用液过柱，淋洗，抽干，加乙腈5 mL，洗脱，收集洗脱液，50℃水浴氮气吹干。加入甲苯、衍生化试剂各100 μL于吹干玻璃管中，混合均匀，封口于80 ℃烘箱衍生60 min，冷却后加入300 μL甲苯，混匀，供GCMS测定。仪器条件表1.仪器方法参数模块参数值色谱进样口温度220 °C进样方式不分流色谱柱系统DB-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 µm)升温程序起始温度100°C，保持1min，以20°C/min升至200 °C，保持3min；20°C/min升至260 °C，保持5min；再以20°C/min升至280 °C，保持3min载气氦气柱流量1 mL/min 恒流模式质谱离子源EI，70eV离子源温度230 °C接口温度280 °C检测器电压-1500 V采集速率1000 amu/s溶剂延迟16 min采集模式选择离子（SIM）结果与讨论1、标准谱图和物质信息实验总离子流图见图1，17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮加标浓度均为1000 μg/L。17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮出峰顺序、保留时间以及特征离子信息见表2。图1 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮衍生物总离子流图表2. 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮保留时间和特征离子信息表序号名 称CAS RT，min定量离子m/z定性离子m/z1雌酮200-164-517.44414399，309，231217β-雌二醇50-28-217.68416232，285，3263炔雌酮57-63-618.97425285，300，4404雌三醇50-27-120.05504311，345，4142、标准曲线取17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮适量，用甲醇稀释成浓度分别为10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、500 μg/L、1000 μg/L系列标准溶液，各量取500 μL加入氮吹玻璃试管中，50 ℃水浴氮气吹干，在吹干玻璃管中加入甲苯、衍生化试剂各100 μL，震荡混合，于80 ℃烘箱衍生60 min冷却后加入300 μL甲苯混匀后进行分析。17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮的线性相关系数R2均大于0.990。（a）雌酮(b) 17β-雌二醇(c) 炔雌醇（d）雌三醇图2 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮标准曲线图3、加标回收实验3.1 精密度和准确度分别对5 g猪肉进行加标实验，最终定容后加标浓度为10 μg/L、100 μg/L、500 μg/L，各六次平行实验，对精密度和准确度进行评估，准确度具体信息详见下表3。目标物浓度为10 μg/L的目标物的相对标准偏差（RSD）在8.5%-14.6%范围内，17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮浓度为100 μg/L和500 μg/L时，RSD分别在7.1%-8.9%和1.1%-1.8%范围内；回收率分别为61.2%-90.8%、60.7%-75.9%、65.3%-106.8%。表3.猪肉加标回收率序号化合物加标浓度（μg/L）101005001雌酮90.8%75.9%106.8%217β-雌二醇61.4%61.3%78.7%3炔雌酮75.2%70.1%78.9%4雌三醇61.2%60.7%65.3%3.2 检出限方法GB31658.7-2021《食品安全国家标准 动物性食品中17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌酮残留量的测定 气相色谱-质谱法》建议对5 g猪肉进行前处理，并最终定容至0.5 mL。测定平行加标样品7次，计算标准偏差（SD），根据方法检出限MDL=t（n-1，0.99）×SD计算各目标化合物的方法检出限。结果如下表4所示，计算可知，17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮方法检出限范围为0.2 μg/L-0.3 μg/L。表4. 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌酮方法检出限序号化合物实测方法检出限（μg/kg）标准要求方法检出限（μg/kg）1雌酮0.20.5217β-雌二醇0.3 0.53炔雌醇0.2 0.54雌三醇0.3 0.5结论本文依据GB31658.7-2021《食品安全国家标准 动物性食品中17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌酮残留量的测定 气相色谱-质谱法》，采用禾信GCMS 1000分析了猪肉基质中17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌酮残。结果显示：17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌酮残的线性相关系数R2均大于0.990；RSD在1.1%-14.6%范围，优于标准要求的RSD≤15%；猪肉中17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌酮残的加标回收率在60.7%-106.8%范围，满足标准要求回收率（60%-110%）；方法检出限在0.2 μg/kg-0.3 μg/kg范围，满足标准要求的检出限0.5 μg/kg。上述结果表明禾信GCMS 1000具有优异的重现性和检测灵敏度。参考文献1. GB31658.7-2021《食品安全国家标准 动物性食品中17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌酮残留量的测定 气相色谱-质谱法禾信质谱 股票代码HEXIN MASS SPECTROMETRY688622 GB 31658.7-2021 分析动物性食品中雌激素类残留量 山 上 MLAA 少 GCMS 1200 GB 31658.7-2021分析动物性食品中雌激素类残留量 前言 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮均 为雌激素类，常在动物性食品中添加使用。畜禽食用含有激素的饲料后，这些激素会沉 积在畜禽的肉和内脏中，人食用含有大量激 素的畜禽产品后，常常会出现心动过速、心 慌、手颤、头晕、头痛等神经中枢调节紊乱 的现象，尤其对高血压、心脏病、糖尿病、甲状腺功能亢进、前列腺肥大患者危险性更 大。同时影响生殖系统，导致性发育提前，食用激素含量高的畜禽产品可使体内雌激 素增高，可能致使男性乳房女性化发育。一 些激素还易引起性发育提前和各种肿瘤，如 卵巢肿瘤、肾脏腺肿瘤等。 本文参考 GB 31658.7-2021《食品安全 国家标准动物性食品中 17β-雌二醇、雌三 醇、炔雌酮和雌酮残留量的测定气相色谱 -质谱法》，使用气相色谱 -质谱联用仪检测 猪肉中的 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌 酮残留量，通过检出限、精密度和准确度等 指标评估仪器性能，证明 GCMS 1000满足 检测的需要。 实验部分 样品前处理 取试样 5 g 于 50 mL 离心管，加醋酸钠 缓冲液 10 mL ，均质 1 min ，涡旋振荡 2 min,加葡萄糖醛酸酶 /芳香基硫酸酯酶 20 uL ，50℃酶解 2 h ，加乙酸乙酯 20 mL ，涡旋振荡 3min ，10000 r/min 离心 5 min ，收集上清液 于 100 mL 鸡心瓶中，残渣中加乙酸乙酯 20mL ，重复提取 1次，合并上清液，40 ℃平 行浓缩仪蒸发至近干，用氢氧化钠溶液 6mL 分 3次溶解洗涤鸡心瓶，洗液转入 50mL 离心管中，加正己烷 20 mL ，涡旋振荡 1 min ，10000 r/min 离心 5 min ，收集下层清 液，加醋酸铵溶液 1mL ，用冰醋酸调 pH 至 5.0~5.2，备用。取 C18固相萃取柱，依次用 甲醇、水各 5mL 活化。取备用液，过柱，分别用水、甲醇水溶液各 5 mL 淋洗，抽干，加甲醇 5 mL 洗脱，收集洗脱液，50 ℃水浴 氮气吹干。加乙酸乙酯正己烷溶液 5 mL 使 溶解，备用；取硅胶固相萃取柱，加正己烷 5 mL 活化，取备用液过柱，淋洗，抽干，加乙腈 5 mL ，洗脱，收集洗脱液，50℃水 浴氮气吹干。加入甲苯、衍生化试剂各 100μL 于吹干玻璃管中，混合均匀，封口于 80 ℃烘箱衍生 60 min ，冷却后加入 300 μL 甲苯，混匀，供 GCMS 测定。 仪器条件 表1.仪器方法参数 模块 参数 值 色谱 进样口温度 220 °C 进样方式 不分流 色谱柱系统 DB-5ms （ 30 m×0.25 mm×0.25 µm) 升温程序 起始温度100°C，保持1min，以20°C/min升至200 °C，保 持 3min； 20°C/min升至 260 °C，保持5min；再以 20°C/min升至280 °C，保持 3min 载气 氦气 柱流量 1 mL/min 恒流模式 质谱 离子源 EI，70eV 离子源温度 230 °C 接口温度 280 °C 检测器电压 -1500 V 采集速率 1000 amu/s 溶剂延迟 16 min 采集模式 选择离子（SIM） 结果与讨论 1、标准谱图和物质信息 实验总离子流图见图 1，17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮加标浓度均为 1000 μg/L 。17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮出峰顺序、保留时间以及特征离子信息见表 2。 图 1 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮衍生物总离子流图 表 2. 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮保留时间和特征离子信息表 序号 名称 CAS RT，min 定量离子 m/z 定性离子 m/z 1 雌酮 200-164-5 17.44 414 399，309，231 2 17β-雌二醇 50-28-2 17.68 416 232，285，326 3 炔雌酮 57-63-6 18.97 425 285，300，440 4 雌三醇 50-27-1 20.05 504 311，345，414 2、标准曲线 取 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮适量，用甲醇稀释成浓度分别为 10 μg/L 、50μg/L 、100 μg/L 、200 μg/L 、500 μg/L 、1000 μg/L 系列标准溶液，各量取 500 μL 加入氮吹 玻璃试管中，50 ℃水浴氮气吹干，在吹干玻璃管中加入甲苯、衍生化试剂各 100 μL ，震 方程: C-0.0169991*A E: 0.993 1200 1000 800 6 400 200 0 +++++++++++++++++++十 0102030 40 5006607080 AW限 (10*3) （a ）雌酮 (b) 17β-雌二醇 (c)炔雌醇 （d ）雌三醇 荡混合，于 80 ℃烘箱衍生 60 min 冷却后加入 300 μL 甲苯混匀后进行分析。17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮的线性相关系数 R2均大于 0.990。 图 2 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮标准曲线图 3、加标回收实验 3.1精密度和准确度 分别对 5 g 猪肉进行加标实验，最终定容后加标浓度为 10 μg/L 、100 μg/L 、500 μg/L ，各六次平行实验，对精密度和准确度进行评估，准确度具体信息详见下表 3。目标物浓度 为 10 μg/L 的目标物的相对标准偏差（RSD ）在 8.5%-14.6%范围内，17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇和雌酮浓度为 100 μg/L 和 500 μg/L 时，RSD 分别在 7.1%-8.9%和 1.1%-1.8%范围 内；回收率分别为 61.2%-90.8%、60.7%-75.9%、65.3%-106.8%。 表 3.猪肉加标回收率 序号 化合物 加标浓度（μg/L） 10 100 500 1 雌酮 90.8% 75.9% 106.8% 2 17β-雌二醇 61.4% 61.3% 78.7% 3 炔雌酮 75.2% 70.1% 78.9% 4 雌三醇 61.2% 60.7% 65.3% 3.2检出限 方法 GB31658.7-2021《食品安全国家标准动物性食品中 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌 酮和雌酮残留量的测定气相色谱 -质谱法》建议对 5 g 猪肉进行前处理，并最终定容至 0.5mL 。测定平行加标样品 7次，计算标准偏差（SD ），根据方法检出限 MDL=t （n-1，0.99）×SD 计算各目标化合物的方法检出限。结果如下表 4所示，计算可知，17β-雌二醇、雌三 醇、炔雌醇和雌酮方法检出限范围为 0.2 μg/L-0.3 μg/L 。 表 4. 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌酮方法检出限 序号 化合物 实测方法检出限 标准要求方法检出限 （μg/kg） （μg/kg） 1 雌酮 0.2 0.5 2 17β-雌二醇 0.3 0.5 3 炔雌醇 0.2 0.5 4 雌三醇 0.3 0.5 结论 本文依据 GB31658.7-2021《食品安全国家标准动物性食品中 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌酮残留量的测定气相色谱 -质谱法》，采用禾信 GCMS 1000分析了猪肉基质中 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌酮残。结果显示：17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌酮残 的线性相关系数 R2均大于 0.990；RSD 在 1.1%-14.6%范围，优于标准要求的 RSD≤15%；猪肉中 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌酮残的加标回收率在 60.7%-106.8%范围，满足标 准要求回收率（60%-110%）；方法检出限在 0.2 μg/kg-0.3 μg/kg 范围，满足标准要求的检 出限 0.5 μg/kg 。上述结果表明禾信 GCMS 1000具有优异的重现性和检测灵敏度。 参考文献 1. GB31658.7-2021《食品安全国家标准动物性食品中 17β-雌二醇、雌三醇、炔雌酮和雌酮 残留量的测定气相色谱 -质谱法