草鱼中4种硝基呋喃代谢物检测

前言硝基呋喃类药物（NFs）是一类广谱抗生素。由于会引发健康问题，大部分监管机构都已禁止对食用动物施用硝基呋喃类药物，由于其产量大、销售范围广，因此存在滥用的风险。硝基呋喃类药物母体仅存在于畜牧生产和水产养殖过程使用的加药饲料中。硝基呋喃类药物母体会在动物体内迅速耗尽并大范围代谢为组织结合代谢物。目前已有针对多种动物组织(例如肾脏)的官方质控方法，以及针对肌肉、蜂蜜、虾、鸡蛋和牛奶的消费者风险评估方法。本文参考GB 31656.13-2021《食品安全国家标准 水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定 液相色谱-串联质谱法》标准，使用液相色谱-串联质谱仪对草鱼中的4种硝基呋喃代谢物进行分析，通过检出限、定量限、精密度、准确度等指标评估质谱仪（禾信LC-TQ 5200）性能，证明禾信LC-TQ 5200满足水产品中4种硝基呋喃代谢物检测的需求。实验部分样品前处理草鱼鱼糜状样品：称取2.0 g试样，置于50 mL具塞离心管中，加入适量的4种硝基呋喃代谢物氘代内标混合标准工作溶液，充分混匀后，加入5.0 mL 0.5 mol/L盐酸溶液和150 μL 0.05 mol/L二硝基苯甲醛衍生溶液，涡旋振荡1 min，置于37℃恒温烘箱进行15 h衍生化反应，取出冷却至室温，加入3.5 mL 1.0 mol/L磷酸氢二钾溶液，调节PH值为7.5左右，加入10 mL乙酸乙酯，涡旋振荡10 min，10000 r/min离心5 min，转移上清液于玻璃试管中，40℃下氮吹近干，用1.0 mL 5%甲醇水溶液复溶，加入1.0 mL正己烷，取下层上清液用0.22 μm有机滤膜过滤，供仪器分析。仪器条件表1. 仪器方法参数模块参数值色谱色谱柱C18（100×2.1 mm，1.8 μm）柱温40℃流动相A相：甲醇；B相：5 mmoL/L甲酸铵溶液流速0.25 mL/min 进样量10 μL洗脱0.00-0.50 min：30%A，70%B; 1.00-4.50 min：65%A，35%B；4.60-8.00 min：30%A，70%B质谱离子源ESI+检测模式多反应监测（MRM）碰撞气0.40 mL/min气帘气5.0 L/min雾化气70 psi加热气8.0 L/min喷雾电压5500V加热温度520℃结果与讨论1、标准谱图和物质信息4种硝基呋喃代谢物总离子流图和MRM色谱图见图1，目标化合物的浓度为1.25 μg/kg，各目标化合物和内标出峰顺序、保留时间以及特征离子信息见表2。图1 4种硝基呋喃代谢物总离子流图表2. 化合物的保留时间和特征离子信息表名 称RT，min定量离子对定性离子对碰撞能量VSEM3.73209/166209/19215，14SEM-13C,15N23.73212/168212/16814AOZ3.67236/134236/10417，30AOZ -D43.65240/134240/13418AHD3.61249/134249/10415，30AHD-13C33.61252/134252/13418AMOZ4.02335/291335/26217，22AMOZ-D54.00340/296340/296162、标准曲线称取空白样品若干份，添加含有4种硝基呋喃代谢物的混合标准工作溶液和4种硝基呋喃代谢物氘代内标的混合标准工作溶液，经过前处理衍生反应，得到草鱼中目标物的质量浓度分别为0.05 μg/kg、0.125 μg/kg、0.25 μg/kg、0.50 μg/kg、1.25 μg/kg、2.50 μg/kg、5.00 μg/kg、12.5 μg/kg的系列浓度样品，对4种硝基呋喃代谢物的混合标准曲线溶液进行分析。4种目标物的线性相关系数R2均大于0.999，详见图3，均符合标准要求。图3  4种硝基呋喃代谢物标准曲线图3、样品加标回收实验对草鱼样品进行加标浓度分别为0.25 μg/kg、0.50 μg/kg、1.25 μg/kg、2.50 μg/kg的加标实验，每个浓度平行实验6次，对精密度和准确度进行评估，4种目标物的相对标准偏差（RSD）在1.0%~7.0%范围，实验结果优于标准的精密度要求。表3. 目标物草鱼样品加标精密度序号化合物目标物加标浓度（μg/kg）0.250.501.252.501SEM2.8%1.6%1.5%1.8%2AOZ1.2%1.0%1.5%1.6%3AHD3.7%1.9%2.0%1.3%4AMOZ7.0%3.3%1.5%3.7%3.1 准确度样品加标浓度在0.25 μg/kg~2.50 μg/kg时，4种目标物的回收率在94.8%~114.6%范围，实验结果符合标准的回收率要求。表4. 目标物草鱼样品加标平均回收率序号化合物目标物加标浓度（μg/kg）0.250.501.252.501SEM98.4%96.4%96.2%94.8%2AOZ102.5%106.6%106.1%102.9%3AHD103.4%109.9%104.6%102.9%4AMOZ100.4%114.6%105.8%103.9%3.2 最低定量限方法GB 31656.13-2021提供了方法学验证中的最低定量限，通过草鱼样品加标实验分析，本方法中4种目标物的方法最低定量限均为0.05 μg/kg，低于标准要求的最低定量限（1.0 μg/kg），体现了禾信LC-TQ 5200具有优异的灵敏度，满足水产品中4种硝基呋喃代谢物的检测要求。结论本文依据GB 31656.13-2021，采用禾信LC-TQ 5200分析了草鱼样品中的4种硝基呋喃代谢物含量。实验结果显示：4种硝基呋喃代谢物的线性相关系数R2均大于0.999，符合标准要求；加标精密度RSD在1.0%~7.0%范围内，满足标准的精密度要求；草鱼样品基质加标平均回收率在94.8%~114.6%范围内，符合标准要求；本方法中4种硝基呋喃代谢物的方法最低定量限均为0.05 μg/kg，远低于标准要求的最低定量限（1.0 μg/kg），体现了禾信LC-TQ 5200具有优异的灵敏度，满足水产品中4种硝基呋喃代谢物的检测要求；定性目标物的特征峰保留时间和相对离子对丰度比及其相对误差均符合标准要求。上述结果表明禾信LC-TQ 5200具有优异的重现性和检测灵敏度，完全满足GB 31656.13-2021标准要求。参考文献1. GB 31656.13-2021食品安全国家标准 水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定 液相色谱-串联质谱法禾信质谱 股票代码HEXIN MASS SPECTROMETRY688622 GB 31656.13-2021草鱼中4种硝基呋喃代谢物检 测 LAN Q M M LC-TQ 5200 ●//// 888 GB 31656.13-2021草鱼中 4种硝基呋喃代谢物检测 前言 硝基呋喃类药物（NFs ）是一类广谱 抗生素。由于会引发健康问题，大部分监 管机构都已禁止对食用动物施用硝基呋 喃类药物，由于其产量大、销售范围广，因此存在滥用的风险。 硝基呋喃类药物母体仅存在于畜牧 生产和水产养殖过程使用的加药饲料中。硝基呋喃类药物母体会在动物体内迅速 耗尽并大范围代谢为组织结合代谢物。目 前已有针对多种动物组织 (例如肾脏 )的 官方质控方法，以及针对肌肉、蜂蜜、虾、鸡蛋和牛奶的消费者风险评估方法。 本文参考 GB 31656.13-2021《食品安 全国家标准水产品中硝基呋喃类代谢物 多残留的测定液相色谱 -串联质谱法》标 准，使用液相色谱 -串联质谱仪对草鱼中 的 4种硝基呋喃代谢物进行分析，通过检 出限、定量限、精密度、准确度等指标评 估质谱仪（禾信 LC-TQ 5200）性能，证 明禾信 LC-TQ 5200满足水产品中 4种硝 基呋喃代谢物检测的需求。 实验部分 样品前处理 草鱼鱼糜状样品：称取 2.0 g 试样，置 于 50 mL 具塞离心管中，加入适量的 4种 硝基呋喃代谢物氘代内标混合标准工作溶 液，充分混匀后，加入 5.0 mL 0.5 mol/L 盐 酸溶液和 150 μL 0.05 mol/L 二硝基苯甲醛 衍生溶液，涡旋振荡 1 min ，置于 37℃恒 温烘箱进行 15 h 衍生化反应，取出冷却至 室温，加入 3.5 mL 1.0 mol/L 磷酸氢二钾 溶液，调节 PH 值为 7.5左右，加入 10 mL 乙酸乙酯，涡旋振荡 10 min ，10000 r/min 离心 5 min ，转移上清液于玻璃试管中，40℃下氮吹近干，用 1.0 mL 5%甲醇水溶液复 溶，加入 1.0 mL 正己烷，取下层上清液用 0.22 μm 有机滤膜过滤，供仪器分析。 仪器条件 表 1. 仪器方法参数 表1. 仪器方法参数 模块 参数 值 色谱 色谱柱 C18（100×2.1 mm，1.8 μm） 柱温 40℃ 流动相 A相：甲醇；B相：5 mmoL/L甲酸铵溶液 流速 0.25 mL/min 进样量 10 μL 洗脱 0.00-0.50 min：30%A，70%B; 1.00-4.50 min：65%A，35%B；4.60-8.00 min：30%A，70%B 离子源 ESI+ 质谱 检测模式 多反应监测（MRM） 碰撞气 0.40 mL/min 气帘气 5.0 L/min 雾化气 70 psi 加热气 8.0 L/min 喷雾电压 5500V 加热温度 520℃ 结果与讨论 1、标准谱图和物质信息 4种硝基呋喃代谢物总离子流图和 MRM 色谱图见图 1，目标化合物的浓度为 1.25 μg/kg ，各目标化合物和内标出峰顺序、保留时间以及特征离子信息见表 2。 图 1 4种硝基呋喃代谢物总离子流图 表 2. 化合物的保留时间和特征离子信息表 名称 RT，min 定量离子对 定性离子对 碰撞能量V SEM 3.73 209/166 209/192 15，14 SEM-13C,15N2 3.73 212/168 212/168 14 AOZ 3.67 236/134 236/104 17，30 AOZ -D4 3.65 240/134 240/134 18 AHD 3.61 249/134 249/104 15，30 AHD-13C3 3.61 252/134 252/134 18 AMOZ 4.02 335/291 335/262 17，22 AMOZ-D5 4.00 340/296 340/296 16 2、标准曲线 称取空白样品若干份，添加含有 4种硝基呋喃代谢物的混合标准工作溶液和 4种硝基 呋喃代谢物氘代内标的混合标准工作溶液，经过前处理衍生反应，得到草鱼中目标物的质 量浓度分别为 0.05 μg/kg 、0.125 μg/kg 、0.25 μg/kg 、0.50 μg/kg 、1.25 μg/kg 、2.50 μg/kg 、5.00 μg/kg 、12.5 μg/kg 的系列浓度样品，对 4种硝基呋喃代谢物的混合标准曲线溶液进行 分析。4种目标物的线性相关系数 R2均大于 0.999，详见图 3，均符合标准要求。 na ly se C o n c ./I S C onc . 图 3 4种硝基呋喃代谢物标准曲线图 3、样品加标回收实验 对草鱼样品进行加标浓度分别为 0.25 μg/kg 、0.50 μg/kg 、1.25 μg/kg 、2.50 μg/kg 的加标 实验，每个浓度平行实验 6次，对精密度和准确度进行评估，4种目标物的相对标准偏差（RSD ）在 1.0%~7.0%范围，实验结果优于标准的精密度要求。 表 3. 目标物草鱼样品加标精密度 序号 化合物 目标物加标浓度（μg/kg） 0.25 0.50 1.25 2.50 1 SEM 2.8% 1.6% 1.5% 1.8% 2 AOZ 1.2% 1.0% 1.5% 1.6% 3 AHD 3.7% 1.9% 2.0% 1.3% 4 AMOZ 7.0% 3.3% 1.5% 3.7% 3.1准确度 样品加标浓度在 0.25 μg/kg~2.50 μg/kg 时，4种目标物的回收率在 94.8%~114.6%范围，实验结果符合标准的回收率要求。 表 4. 目标物草鱼样品加标平均回收率 序号 化合物 目标物加标浓度（μg/kg） 0.25 0.50 1.25 2.50 1 SEM 98.4% 96.4% 96.2% 94.8% 2 AOZ 102.5% 106.6% 106.1% 102.9% 3 AHD 103.4% 109.9% 104.6% 102.9% 4 AMOZ 100.4% 114.6% 105.8% 103.9% 3.2最低定量限 方法 GB 31656.13-2021提供了方法学验证中的最低定量限，通过草鱼样品加标实验分 析，本方法中 4种目标物的方法最低定量限均为 0.05 μg/kg ，低于标准要求的最低定量限 （1.0 μg/kg ），体现了禾信 LC-TQ 5200具有优异的灵敏度，满足水产品中 4种硝基呋喃代 谢物的检测要求。 结论 本文依据 GB 31656.13-2021，采用禾 信 LC-TQ 5200分析了草鱼样品中的 4种 硝基呋喃代谢物含量。实验结果显示：4种 硝基呋喃代谢物的线性相关系数 R2均大 于 0.999，符合标准要求；加标精密度 RSD 在 1.0%~7.0%范围内，满足标准的精密度 要求；草鱼样品基质加标平均回收率在 94.8%~114.6%范围内，符合标准要求；本 方法中 4种硝基呋喃代谢物的方法最低定 量限均为 0.05 μg/kg ，远低于标准要求的最 低定量限（1.0 μg/kg ），体现了禾信 LC-TQ 5200具有优异的灵敏度，满足水产品中 4种硝基呋喃代谢物的检测要求；定性目标 物的特征峰保留时间和相对离子对丰度比 及其相对误差均符合标准要求。上述结果 表明禾信 LC-TQ 5200具有优异的重现性 和检测灵敏度，完全满足 GB 31656.13-2021标准要求。 参考文献 1. GB 31656.13-2021食品安全国家标准水产品中 硝基呋喃类代谢物多残留的测定液相色谱 -串联 质谱法