猪肉中瘦肉精检测方案

气相色谱质谱联用测定猪肉中的瘦肉精的含量 摘要：建立了猪肉中盐酸克伦特罗的气相色谱-质谱联用的检测方法。样品提取后，用C18小柱和聚(甲基丙烯酸一乙二醇二甲基丙烯酸酯)整体柱进一步富集净化，经N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺 (BSTFA)衍生，选择离子监测方式进行气相色谱质谱测定。该方法以克伦特罗同位素(Clenbuterol-D9) 为内标，内标法定量。猪肉中克伦特罗的检出限为 0.13ug/kg， 在0.5~50 ug/kg 的浓度范围内具有良好的线性关系，r大于0.999。日内、日间相对标准偏差不高于20%，加标回收率大于75%。结果表明，该方法简单、快速、灵敏度高、重现性好，适用于猪肉中克伦特罗的测定。 关键词：盐酸克伦特罗气相色谱-质谱 克伦特罗(clenbuterol) 是一种βz-受体激动剂，它可显著提高猪、牛、羊等家禽的瘦肉率和饲料转化率。但如长期食用，会在动物体内形成积累性残留，引起急性中毒。然而有些不法分子为追求经济效益，仍将其利用于畜牧业生产中。因此建立一种快速、灵敏、准确、稳定的检测方法是控制克伦特罗非法使用的迫切任务。 目前，常用的检测方法有酶免疫法、HPLC法、LC-MS法、GC-MS法等。因GC-MS法具有灵敏度高、假阳性率低的特点，常用作筛选后阳性样品的确证。本实验针对盐酸克伦特罗的化学性质，建立了Ci8小柱和聚(甲基丙烯酸一乙二醇二甲基丙烯酸酯)整体柱二维萃取的方法，本方法具有灵敏、准确、稳定的特点。 1.实验部分 1.1仪器与试剂 仪器：岛津GCMS-QP2010Plus； 试剂：盐酸克伦特罗(Clenbuterol，CLB)标准品，内标 (Clenbuterol-D9， CLB-D，)，N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺 (BSTFA)， C18固相萃取小柱 (100 mg， 3mL) 标准溶液的配制：准确称取盐酸克伦特罗和内标的标准品，用甲醇配成浓度为1 mg/mL的标准储备液，放置于4℃冰箱中避光保存，使用时用甲醇稀释成1 ug/mL的标准使用液和内标使用液。 1.2分析条件 色谱柱：Rtx-5MS (30 mx0.25 mmx0.25 um) 进样口温度：220℃柱温程序：70℃(0.6 min)-25℃/min-220℃(6 min)-25℃/min-280℃(5min)恒线速度方式，柱流量0.9 mL/min不分流进样，进样时间1 min接口温度：280℃离子源温度：200℃溶剂切割时间：8 min检测离子：CLB：检测 m/z 86，187，243，262，CLB-D9：检测 m/z 95，187，262以克伦特罗 (m/z86) 与内标峰 (m/z 95)的峰面积比校准定量。 1.3样品制备 精密称取(2±0.01) g己绞碎的猪肉于具塞离心管中，加入4 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，旋涡振荡5 min， 超声 10 min， 12000 r/min 离心5 min后，倾出上清液，沉淀再分别用 0.1 mol/L 盐酸4mL， 2mL两次提取，提取方法同上，合并上清液。 将上清液全部上样至C18柱，用5mL水清 洗小柱后，使用0.8mL甲醇：20 mmol/L 磷酸溶液=1：1(v/v)的酸化甲醇解析，加磷酸缓冲液调至pH=7，定容至2mL。将该溶液以 0.1 mL/min的流速推过聚(甲基丙烯酸一乙二醇二甲基丙烯酸酯)毛细管整体柱萃取后，用0.2mL的甲醇解析，加50 uL的内标使用液后以氮吹仪浓缩至干。加入100 uL甲苯和100 uLBSTFA， 涡旋混匀30 s，置于微波炉中小火衍生5min。衍生反应完成后取出冷却至室温后再加入300 uL甲苯，充分混匀，待气质联用仪进样。 2.分析结果 2.1盐酸克伦特罗的 GCMS测定 图1为衍生化克伦特罗和内标的质谱图，本文以克伦特罗碎片离子 (m/z86)与内标碎片离子(m/z 95) 的浓度比值为横坐标，峰面积比值为纵坐标进行定量。图2为空白猪肉和添加2.5ug/kg 克伦特罗的猪肉样品提取液的离子流图，内标 (Peak 1) 和克伦特罗 (Peak 2)的保留时间分别为 9.83 min 和 9.92 min， 空白猪肉样品在被测物及内标处均无干扰。 % 图1.衍生物质谱图(a)克伦特罗；(b)代克伦物罗 2.2标准曲线 图2.GC-MS-MIC离子流图 (a)空白猪肉；(b)添加2.5 ug/kg克伦特罗的猪肉样品 分别添加不同体积的克伦特罗标准溶液(1 ug/mL) 和50 pL内标溶液于2g猪肉样品中(其中克伦特罗的质量分别为1、5、10、20、40和100ng)，样品的处理方法如上所述，以克伦特罗与内标的峰面积的比值对浓度比值进行线性回归，发现克伦特罗在 0.5-50ug/kg 的浓度范围内，线性关系良好，相关系数大于0.999。 2.3检测限及精密度 以信噪比的3倍和10倍分别计算检测限和定量限，方法检测限为0.13 ug/kg，定量限为0.43ug/kg。该方法有较好的日内及日间精密度，在定量限附近，相对标准偏差小于20%(见表1)，可满足分析要求。 表1.克伦特罗的方法学数据 添加浓度 回收率 日内精密度 日间精密度 (ug/kg) (%) (%) (%) 0.5 76.5 14.7 19.7 5 92.3 10.8 11.7 25 80.4 4.6 5.4 2.4实际样品分析 根据以上建立的方法，对市场上五种不同品牌的猪肉进行了分析(n=3)，其中3种未检出克伦特罗，2种猪肉中的克伦特罗超过国家标准，具体结果见表2。 表2样品检测结果 样品 样品 样品 样品 样品 样品 2 3 4 5 平均浓度 (ug/kg) n.d. n.d. 0.72 n.d. 1.67 注： n.d.指在本方法的仪器检测限下未检出 2.5结论 本文建立了气相色谱质谱联用测定猪肉中盐酸克伦特罗的分析方法。该方法具有检测限低、重现性好、回收率高、样品用量少等特点，适合于猪肉样品中盐酸克伦特罗的定性、定量测定。