猪肉中多兽药残留检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-689Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-342 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱三重四极杆质谱联用测定猪肉中多兽药残留 LCMSMS-342 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用测定猪肉中多兽药残留的方法。该方法使用岛津技迩 WondaPak QuEChERS 兽兽专用产品对猪肉样品进行净化， Shim-pack GIST色谱柱进行分离，在16 min 内完成130种兽药的分析，涉及的兽药种类包括磺胺类、喹诺酮类、四环素类、硝基咪唑类、β-内酰胺类、氯霉素类、激素类、β-受体激动剂类、大环内酯类、苯并咪唑类、糖皮质激素类等22类，所得校准曲线线性良好，相关系数均在0.991以上；低、中、高不同浓度的混合标准溶液平行测试6次，130种兽药的保留时间和峰面积相对标准偏差 (RSD) 在 0.03~0.31%和0.29~10.88%之间，仪器精密度良好；配制加标浓度为1 ug/kg、5 ug/kg 和10 ug/kg 的样品进样检测，加标回收率在 40.39~121.14%之间。综上所述，该方法具有分析速度快、重复性好、灵敏度高的特点，可适用于猪肉中多兽药残留同时检测。 关键词：多兽残 QuEChERS 猪肉超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪 近年来，兽药在养殖业、畜牧业中的应用日趋广泛，合理使用兽药可以有效预防和治疗禽畜动物疾病，遏制流行病的传播，保障公共卫生安全等方面发挥着重要作用。但受市场经理利益驱动等因素，部分养殖户在在养殖过程中大量使用抗生素、化学添加剂、激素甚至非法违禁添加物，导致动物源性食品中兽药残留，引发食品安全事件，严重危害人类健康。因此，兽药残留问题已成为普遍关注的社会热点，我国也颁布了相关法律法规，规定动物源食品中兽药残留限量。但动物源食品种类繁多，样品基质复杂，检测的目标物种类理化性质差异较大，我国的兽药残留量测定标准中大多以分类检测为主，一个样本需多次检测，降低了检测效率。 QuEChERS 方法因高效、快速、易于操作，广泛应用于农药检测领域。近年来，已有相关报道将该技术应用到兽药检测领域，一次处理即可完成多种兽药的筛查，简化样品前处理方法，提高了分析检测效率。 本文参考中国农业部发布的235公告《动物性食品中兽药最高残留限量》，以猪肉为基质，对规定的最大残留限量药物和禁用药物，涉及的种类包括磺胺类、喹诺酮类、β-受体激动剂类、大环内酯类、苯并咪唑类、激素类等22大类，通过QuEChERS 方法进行净化和提取，使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050联用系统，对猪肉中的多兽药残留进行检测。 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用系统。具体配置为LC-30ADx2(输液泵)， DGU-20A5R(在线脱气机)， SIL-30AC(自动进样器)， CTO-20A(柱温箱)， CBM-20A 系统控制器，LCMS-8050 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 6.81色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GIST 2.1 mm I.D.x100 mm L.，柱温：40℃2um进样量：10 pL流动相：A相-0.1%甲酸+2 mmol/L乙酸铵水溶液；洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为10%，洗脱B相-甲醇程序见表1 表1梯度洗脱程序 Time (min) Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 10 3.00 Pumps Pump B Conc. 30 8.00 Pumps Pump B Conc. 70 10.00 Pumps Pump B Conc. 100 13.00 Pumps Pump B Conc. 100 13.10 Pumps Pump B Conc. 10 16.00 Controller Stop 质谱条件 离子源： ESI 加热模块温度：400℃ 雾化气流速：3.0L/min 干燥气流速：10.0L/min 加热气流速：10.0L/min 扫描模式：多反应监测 (MRM) 接口温度：300℃ 驻留时间：10 ms DL温度：250℃ MRM参数：见表2 表2 MRM参数 名称 英文名 CAS No. 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias (V) 羟基甲硝唑 Hydroxymetroni 4812-40-2 188.10 126.10* -23 -16 -23 dazole 123.10 -23 -14 -22 202.10* -11 -11 -22 西马特罗 Cimaterol 54239-37-1 220.20 143.10 -26 -23 -27 152.00* -11 -16 -28 特布他林 Terbutaline 23031-25-6 226.10 125.10 -26 -23 -24 144-80-9 215.00 156.00 * -23 -10 -29 磺胺醋酰 Sulfacetamide 92.00 -23 -23 -17 甲硝唑 443-48-1 172.00 81.80* -14 -25 -16 Metronidazole 127.70 -14 -15 -26 156.00* -23 -14 -16 磺胺甲噻二唑 Sulfamethizole 144-82-1 271.00 108.00 -22 -23 -19 西布特罗 Cimbuterol 54239-39-3 234.20 143.10* -27 -25 -26 160.10 -24 -15 -29 磺胺嘧啶 Sulfadiazine 68-35-9 251.00 156.00* -30 -15 -29 92.10 -30 -25 -17 咪多卡二丙酸 Imidocarb 55750-06-6 349.15 188.10* -11 -30 -18 盐 dipropionate 162.15 -10 -26 -15 2-Amino-5-prop 133.20 * -15 -27 -24 阿苯达唑-2-氨 基砜 80983-34-2 240.30 ylsulphonylbenz imidazole 198.10 -15 -18 -21 LCMSMS-342 注：*表示定量离子对 1.3标准溶液的配制 将猪肉样品用匀浆机充分匀浆，精密称取匀浆样品5.0 g，加入5.0 mL 水振摇30 s， 加入10 mL5%甲酸乙腈涡旋混匀30s，加入WondaPak QuEChERS 多兽残专用提取包，涡旋混匀30 s， 8000 rpm 离心5 min， 取 2 mL 上清液转移至 WondaPak QuEChERS 多兽残专用净化包，涡旋混匀30 s， 8000rpm 离心5 min， 取上清液1mL，室温下氮吹至近干，加入10%甲醇水溶液定夜至1mL，超声溶解30s， 过0.22 um微孔滤膜，得空白基质溶液。 精确称取适量标准品，用甲醇溶解配制成浓度为 500 ng/mL 的130种兽药混合标准品储备液，使用空白基质稀释成浓度为 0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL 、5 ng/mL、10 ng/mL 和 20 ng/mL 的混合标准溶液。 结果与讨论 2.1标准样品的色谱图 混合标准样品的 MRM 色谱图如图1所示。 图1浓度为1 ng/mL标准品的MRM色谱图 2.2线性关系 精密称取猪肉样品5.0g，按1.3下提取和净化方法处理后，得到空白基质提取液，使用该基质溶液稀释储备液，配制成不同浓度的标准工作液，按1.2中的分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法制作校准曲线，线性方程、线性范围和相关系数数表3。 表3校准曲线参数(线性回归，权重为1/C²) 序号 名称 校准曲线 线性范围 准确度(%) 相关系 (ng/mL) 数r 羟基甲硝唑 Y=(7198.12)X+(-872.146) 0.5~20 97.2~105.6 0.9986 2 西马特罗 Y=(176258)X+(24700.0) 0.2~20 92.4~102.6 0.9992 3 特布他林 Y=(42205.5)X+(-569.202) 0.2~20 94.8~103.4 0.9993 4 磺胺醋酰 Y=(43569.4)X+(693.138) 0.2~20 94.8~109.2 0.9986 5 甲硝唑 Y=(17077.5)X+(1132.49) 0.2~20 95.7~110.2 0.9983 6 磺胺甲噻二唑 Y=(54333.4)X+(-562.160) 0.2~20 93.7~108.2 0.9984 7 西布特罗 Y=(174783)X+(-535.471) 0.2~20 98.8~102.2 0.9999 8 磺胺嘧啶 Y=(82641.5)X+(-201.613) 0.2~20 97.7~103.2 0.9996 9 咪多卡二丙酸盐 Y=(110826)X+(1441.20) 0.2~20 90.3~109.4 0.9977 10 阿苯达唑-2-氨基砜 Y=(71438.6)X+(-358.157) 0.2~20 98.1~102.6 0.9998 11 替硝唑 Y=(36021.5)X+(3962.63) 0.2~20 94.5~102.9 0.9995 12 盐酸苯乙双胍 Y=(631182)X+(11962.9) 0.2~20 97.6~101.5 0.9999 13 吡哌酸 Y=(194494)X+(287.809) 0.2~20 97.9~102.7 0.9998 14 磺胺噻唑 Y=(66745.2)X+(-995.510) 0.2~20 97.3~102.5 0.9998 15 马波沙星 Y=(79123.4)X+(1475.57) 0.2~20 96.5~102.4 0.9997 16 5-羟基噻苯哒唑 Y=(141183)X+(2717.25) 0.2~20 96.3~102.8 0.9996 122 氟替卡松丙酸酯 Y=(13434.2)X+(968.181) 0.5~10 88.0~110.9 0.9921 123 格列美脲 Y=(40415.5)X+(-6843.21) 0.5~10 91.2~106.3 0.9973 124 甲羟孕酮 Y=(54433.1)X+(-4177.92) 0.2~20 97.2~104.5 0.9996 125 苯硫胍 Y=(236171)X+(-11157.2) 0.2~20 94.8~104.7 0.9993 126 氯地孕酮乙酸酯 Y=(19517.6)X+(-252.401) 0.5~20 94.1~106.2 0.9984 127 瑞格列奈 Y=(1.35749e+006)X+(-21471.7) 0.2~20 95.0~102.9 0.9995 128 倍他米松双丙酸酯 Y=(5903.23)X+(-1269.33) 0.5~20 89.5~108.3 0.9963 129 康力龙 Y=(20619.7)X+(1571.16) 0.5~20 94.1~109.3 0.9980 130 沙丁胺醇 Y=(232137)X+(2570.10) 0.2~20 97.7~103.9 0.9997 2.3精密度实验 使用空白基质配制浓度为 1 ng/mL、5 ng/mL 和 10 ng/mL 的混合标准溶液连续6次进样，考察仪器的精密度，结果如表4所示，保留时间和峰面积相对标准偏差(RSD)在 0.03~0.31%和0.29~10.88%之间，仪器精密度良好。 表4保留时间和峰面积重复重结果(n=6) 序 样品名称 RSD% (1ng/mL) RSD% (5ng/mL) RSD% (10ng/mL) 号 R.T. Area R.T. Area R.T. Area 1 羟基甲硝唑 0.20 4.64 0.16 1.98 0.31 1.60 2 西马特罗 0.18 1.52 0.17 0.69 0.28 0.29 3 特布他林 0.17 3.95 0.19 1.00 0.31 0.44 4 沙丁胺醇 0.18 1.23 0.16 0.81 0.26 0.90 5 磺胺醋酰 0.12 3.54 0.15 1.89 0.30 0.76 6 甲硝唑 0.15 3.54 0.11 2.20 0.23 1.02 西布特罗 0.19 2.49 0.12 0.77 0.20 0.57 8 磺胺嘧啶 0.14 2.78 0.11 1.42 0.18 1.23 9 咪多卡二丙酸盐 0.13 3.09 0.10 1.95 0.14 0.67 10 磺胺噻唑 0.12 1.55 0.10 1.72 0.15 1.62 11 阿苯达唑-2-氨基砜 0.13 5.39 0.09 1.89 0.15 0.79 12 替硝唑 0.12 1.30 0.09 0.76 0.16 0.46 13 磺胺吡啶 0.12 2.02 0.08 1.38 0.15 1.26 14 盐酸苯乙双胍 0.13 1.35 0.08 1.17 0.13 0.53 15 吡哌酸 0.13 3.41 0.08 1.34 0.13 0.37 16 马波沙星 0.13 3.29 0.08 0.93 0.12 1.08 17 5-羟基噻苯哒唑 0.11 1.91 0.08 1.42 0.12 1.12 18 磺胺甲基嘧啶 0.12 1.39 0.08 1.74 0.12 2.03 19 氟罗沙星 0.12 2.81 0.08 0.76 0.11 0.37 125 甲羟孕酮 0.04 1.90 0.03 1.08 0.04 1.52 126 苯硫胍 0.03 3.20 0.03 3.34 0.04 1.68 127 氯地孕酮乙酸酯 0.04 3.46 0.03 0.87 0.04 1.88 128 瑞格列奈 0.04 2.79 0.04 0.98 0.04 0.82 129 倍他米松双丙酸酯 0.04 4.60 0.04 1.88 0.04 1.96 130 康力龙 0.03 5.27 0.03 2.13 0.04 1.35 2.4检出限和定量限 对猪肉样品按照1.3中处理方法得到浓度为 0.1 ng/mL 的加标样品进样分析，通过软件计算得130种兽药的最低检出限(S/N=3)、最低定量限(S/N=10)，结果如表5所示。 表5153种兽药的检出限和定量限 序号 化合物名称 定量限 (ng/mL) 检出限(ng/mL) 1 羟基甲硝唑 0.217 0.072 2 西马特罗 0.012 0.004 3 特布他林 0.072 0.024 4 磺胺醋酰 0.009 0.003 5 甲硝唑 0.059 0.020 6 磺胺甲噻二唑 0.062 0.020 7 西布特罗 0.006 0.002 8 磺胺嘧啶 0.010 0.003 9 咪多卡二丙酸盐 0.032 0.010 10 阿苯达唑-2-氨基砜 0.073 0.024 11 替硝唑 0.052 0.017 12 盐酸苯乙双胍 0.040 0.013 13 吡哌酸 0.017 0.005 14 磺胺噻唑 0.003 0.001 15 马波沙星 0.093 0.031 16 5-羟基噻苯哒唑 0.003 0.001 17 磺胺甲基嘧啶 0.011 0.004 18 氟罗沙星 0.018 0.006 19 杀虫脒 0.052 0.017 20 氧氟沙星 0.025 0.008 21 依诺沙星 0.008 0.003 22 培氟沙星 0.039 0.013 23 莱克多巴胺 0.062 0.021 24 诺氟沙星 0.042 0.014 25 四环素 0.013 0.004 2.5 基质加标实验 猪肉样品按1.3中前处理方法进行提取和净化，进样检测，所得空白样品色谱图如图2。对5.0 mL空白猪肉样品进行加标，使得加标浓度分别为1 ug/kg、5 ug/kg 和10 ug/kg， 按1.3中前处理方法进提提取和净化，每个浓度样品平行3次实验，所得结果如表6所示， 1 ug/kg 加标浓度的回收率在 40.39~121.14%之间；5 ug/kg 加标浓度的回收率在 43.13~112.84% 之间； 10 ug/kg 加标浓度的回收率在 45.36~114.92%之间。将三个浓度下所得回收率结果分四类：回收率小于50%、51~80%之间、81~120%之间和大于120%，结果如图3。可见， 在5 ug/kg 和10 ug/kg加标浓度下，超过55%的化合物回收率在81~120%之间，即使加标浓度为1 ug/kg，仅有1%的化合物回收率大于1120%，回收率良好；使用该方法平行处理三份样品的重现性统计结果如图4，可见在5 ug/kg 和10 ug/kg 加标浓度下，超过80%的化合物 RSD在0~10%之间，表明前前处理和检测方法重现性良好。 图22 ：空白样品色谱图 图3猪肉中不同加标浓度回收率结果统计 图4猪肉中不同加标浓度回收率重现性统计 表6加标样品的回收率结果(n=3) 化合物名称 加标浓度 0.5 ng/mL 加标浓度 5 ng/mL 加标浓度20ng/mL 回收率% RSD% 回收率% RSD% 回收率% RSD% 磺胺类 磺胺醋酰 56.76 9.17 70.34 3.89 70.31 5.23 磺胺嘧啶 58.64 15.79 70.30 4.97 72.51 4.00 磺胺甲基嘧啶 58.20 12.22 70.38 2.93 71.17 2.85 磺胺甲噻二唑 58.11 12.28 72.07 4.12 71.98 4.94 磺胺对甲氧嘧啶 64.15 11.73 78.75 3.54 78.99 1.75 磺胺二甲嘧啶 56.03 33.27 74.14 3.82 69.64 4.03 磺胺甲氧哒嗪 54.44 11.59 68.65 3.49 67.72 4.88 磺胺氯哒嗪 56.07 12.49 77.40 5.37 81.48 3.33 磺胺甲氧吡嗪 62.49 8.98 74.78 7.71 75.65 3.65 磺胺甲噁唑 60.93 12.64 71.18 6.70 73.39 4.09 磺胺间甲氧嘧啶 50.43 18.45 75.54 7.02 77.33 3.81 磺胺二甲基异噁唑 66.19 11.93 78.65 5.13 80.38 1.97 磺胺邻二甲氧嘧啶 70.19 8.67 78.63 4.19 84.46 6.24 球磺胺 55.99 8.06 71.14 4.43 72.76 2.91 磺胺苯酰 61.74 11.47 73.05 4.04 73.13 2.66 磺胺苯吡唑 54.28 9.91 66.48 9.45 68.44 4.96 磺胺氯吡嗪 52.55 16.40 72.60 9.16 77.87 3.47 磺胺间二甲氧嘧啶 62.08 9.69 74.09 5.55 76.06 3.50 磺胺噻唑 49.39 8.66 58.11 5.19 60.21 5.06 磺胺吡啶 44.63 9.46 58.00 3.28 59.74 3.65 磺胺噁唑 46.93 8.51 63.44 3.62 63.60 4.63 磺胺喹噁啉 52.72 11.88 63.14 7.30 65.59 6.73 甲烯土霉素 66.94 11.49 88.37 5.80 85.53 5.47 100.19 吡罗昔康 88.67 5.49 103.17 5.26 105.18 3.15 非甾体类 舒林酸 60.52 19.07 57.44 18.82 56.44 19.76 抗炎药 萘丁美酮 83.75 13.47 77.52 10.37 75.92 7.45 结论 建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用测定猪肉中多兽药残留的方法。该方法在 16 min 内完成130种兽药的分析，涉及的兽药种类包括磺胺类、喹诺酮类、四环素类、硝基咪唑类、β-内酰胺类、氯霉素类、激素类、β-受体激动剂类、大环内酯类、苯并咪唑类、糖皮质激素类等22类，所得校准曲线线性良良；低、中、高不同浓度的混合标准溶液平行测试6次，130种兽药的保留时间和峰面积RSD 在 0.03~0.31%和0.29~10.88%之间，仪器精密度良好；配制加标浓度为 1 ug/kg、5 ug/kg 和 10 ug/kg 的样品进样检测，加标回收率在 40.39~121.14%之间之间。表明该方法具有分析速度快、重复性好、灵敏度高的特点，可适用于猪肉中多兽药残留同时检测。 田岛津全球应用技术开发支持中心 使用岛津技迩WondaPak QuEChERS兽残专用产品对猪肉样品进行净化，Shim-pack GIST色谱柱进行分离，在16 min内完成130种兽药的分析，涉及的兽药种类包括磺胺类、喹诺酮类、四环素类、硝基咪唑类、β-内酰胺类、氯霉素类、激素类、β-受体激动剂类、大环内酯类、苯并咪唑类、糖皮质激素类等22类。