人血清中25-羟基维生素D检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-707Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-348 岛津全球应用技术开发支持中心上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn 应用 Nexera MX System 平行液相三重四极杆质谱联用系统检测人血清中25-羟基维生素 D，/D含量 LCMSMS-348 摘要：本文使用岛津Nexera MX System 平行液相系统和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用，建立了血清中25-羟基维生素 D，/D，的定量检测方法，并依据临床检验相关指导原则完成了方法学验证。实验结果表明，该方法对血清中25-羟基维生素 D，/D， 测定的可报告范围分别为为 0.3900-50.00 ng/mL、1.172-150.0 ng/mL；精密度(CV%)分别为1.6-3.1%，准确度范围分别为 96.9- 106.9%。该方法分析速度快、稳定性和准确度好，且大大提高了分析效率，节省仪器采购与检测成本，适用于血清中25-羟基维生素D，/D，的定量分析，能够为临床检验行业的从业人员提供参考。 关键词：LCMS-804525-羟基维生素 D/D， 血清临床检验 维生素D是一类脂溶性激素，对人体的骨骼健康，钙、磷的体内平衡调节起到重要作用，此外维生素D还有着广泛的非骨骼效应，与心血管疾病、免疫疾病、糖尿病和肿瘤等疾病密切相关。维生素Ｄ的缺乏可导致骨骼发育受损，以及各类慢性疾病的发病风险增加，如类风湿性关节炎、软骨化、冠心病、糖尿病和肿瘤等。人体维生素Ｄ的来源主要有两个途径，一是通过膳食途径摄入的维生素D(酵母或真菌)和维生素D(鱼、鱼肝油或蛋黄)，二是机体经光照将皮肤中的7-脱氢胆甾醇转化为维生素Ds。 维生素D在肝脏中可转化为25-羟基维生素 D(25-OHD)， 从而被机体转运或储藏，因此体内25-OHD 含量可有效反映人体维生素D的营养状态。此外， 25- OHD 在体内稳定，半衰期长，其浓度水平与体内维生素D含量直接相关，因此 25-OHD可作为一类主要的生物标志物用于体现机体维生素Ｄ水平。 目前， 25-OHD 的检测方法有多种，包括免疫检测、HPLC 法和 LC-MS/MS 方法等。其中， LC-MS/MS 法具有特异性强、准确度高、分析时间短等特点，被认为是评价机体维生素D营养状况的“金标准”。对此，我们使用岛津 Nexera MX System 平行液相系统和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用，建立了血清中25-OHD，/D，的定量分析方法，该方法是第一次将平行液相技术应用于25-OHD，/D，的检测，较常规LCMS方法，极大地缩短了分析检测时间，降低了设备及分析成本，提高了检测效率及经济效益，凸显了该技术的优势。 1.1仪器 岛津 Nexera MX System 平行液相系统与三重四极杆质谱仪 LCMS-8045联用系统。具体配置为： LC-20ADxpx4输液泵， DGU-20A5R*2在线脱气机， SIL-30ACMP 自动进样器， CTO-20AC 柱温箱， CBM-20A 系统控制器， LCMS-8045三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver. 5.89 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack XR-C8(2.0 mm I.D.x50 mm L.，自动进样器温度：4℃2.2um)洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为85%，时间流动相：A相-0.1%甲酸水B相-0.1%甲酸-2mM程序见表1-3乙酸铵-甲醇阀切换时间：0.15 min流速：0.4mL/min液相模式： Binary gradient ×2柱温：25℃平行液相分析模式： Automatic 1 进样量：20pL 表1parallel LC 1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 85 0.51 Pumps Pump B Conc. 98 2.00 Controller Stop 表2：1parallel LC 2梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0 Pumps Pump B Conc. 85 2.00 Controller Stop 表3单液相梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.5 Pumps Pump B Conc. 85 0.51 Pumps Pump B Conc. 98 1.60 Pumps Pump B Conc. 98 1.61 Pumps Pump B Conc. 85 4.00 Controller Stop 图1：液相分析条件 图2液相冲洗平衡条件 1. Loading SampleHold as initial condition until the sample injected from Autosampler is loaded out of flow selectionvalve. 2. Cutting Off Autosampler Flow Path Switch flow selection valve and cut off Autosampler flow path. 图3parallel LC 简易设计图及工作原理示意图 图4 Parallel LC分析方法切换方式示意图 图55MXSolution软件布局及功能 质谱条件 离子子： ESI(+) 加热模块温度：500℃ 雾化气流速：3.0L/min 干燥气流速：10.0L/min 加热气流速：10.0L/min 扫描模式：多反应监测 (MRM) 接口温度：300℃ 驻留时间：100ms DL 温度：150℃ MRM参数：见表4 表44MRM参数 名称 CAS No. 前体离子 产物离子 Qi Pre Bias (V) CE (V) Q： Pre Bias (V) 25-OHD2 21343-40-8 413.3 337.3 -15.0 -11.0 -24.0 25-OHD3 63283-36-3 401.3 365.4 -20.0 -11.0 -17.0 d3-25-OHD2 416.3 340.4 -12.0 -12.0 -21.0 d6-25-OHD： 一 407.3 371.3 -29.0 -11.0 -25.0 1.3样品制备 1.3.1标准工作曲线配制 用乙醇配制 25-OHD，和25-OHD，浓度分别为 100 ug/mL、300 ug/mL的混合标准储备液，随后用75%甲醇(0.1%甲酸)将混合标准储备溶液逐级稀释成浓度为 0.3900 ng/mL、0.7810 ng/mL、1.563 ng/mL、2.344 ng/mL、6.250 ng/mL、12.50 ng/mL、25.00 ng/mL 和50.00 ng/mL 的25-OHD，标准工作液；1.172 ng/mL、2.344 ng/mL、4.688 ng/mL、9.375ng/mL、18.75 ng/mL、37.50 ng/mL、75.00 ng/mL、150.0 ng/mL 的25-OHD，标准工作液；用乙醇配制d3-25-OHD， 和d6-25-0HD， 浓度分别为100.0 pg/mL、300.0 ug/mL的的混合内标储备液，再用75%甲醇(0.1%甲酸)稀释为浓度为50.00 ng/mL、150.0 ng/mL 的内标工作液。 1.3.2样品前处理方法 取100 uL血清样品或标准工作液于1.5 mL离心管中，加入10 pL内标溶液，充分混匀；加入200 pL乙醇；剧烈震荡30 s， 室温静置15min；加入1mL正己烷，剧烈震荡 30 s， 14000 g以上离心5 min； 取最上层有机层850pL，室温下氮气吹干，加入75%甲醇(0.1%甲酸)溶液100pL，充分混匀30s。 结果与讨论 2.1 MRM 色谱图 图6定量下限0.3900 ng/mL25-OHD，和1.172 ng/mL 25-OHD，色谱图 2.2线性关系 采用内标法建立标准曲线。如图7所示， 25-OHD，在 0.3900-50.00 ng/mL 的线性浓度范围内， 25-OHD，在1.172-150.0 ng/mL线性相关性良好，相关系数r分别为 0.9998 和0.9998，准确度范围分别为97.6-105.2%和99.5-103.8%。 图7 25-OHD，和25-OHD，的标准曲线 表55标准曲线结果 目标物 线性方程 相关系数 准确度 25-OHD2 Y=(0.153748)X+(-7.87094e-005) 0.9998 97.6-105.2% 25-OHD； Y=(0.0215177)X+(-0.000397393) 0.9998 99.5-103.8% 2.3检出限与定量限 将25-OHD，与 25-OHD， 的标准曲线最低点用稀释液逐级稀释得到信噪比约为3时，得到检出限，浓度分别为0.0390 ng/mL 与 0.1172 ng/mL， 色谱图见图 8-9。 图8225-OHD，检出限色谱图 图9 25-OHD，检出限色谱图 关于定量下限的确定，综合考虑定量下限的准确度与精密度以及人体中25-OHD 的实际含量范围，经验证，25-OHD，与25-OHD，的定量下限分别为 0.3900 ng/mL 与 1.172 ng/mL时，更加能够保证检测的准确有效性。色谱图见图6。 2.4精密度验证 分别取处理后且已知浓度的低、高两个浓度的质控样品， 25-OHD，即 LQC(2.439 ng/mL)、HQC(9.367 ng/mL)，25-OHD， 即LQC=5.297 ng/mL、HQC=26.28 ng/mL。样品经分析后，数据统计分析得到变异系数(CV%)结果如表6所示。 表66精密度考察结果(n=6) 样品号 25-OHD2 (ng/mL) 25-OHD3(ng/mL) LQC HQC LQC HQC 1 2.364 9.159 5.249 28.09 2 2.415 9.541 5.384 28.00 3 2.435 9.111 5.133 26.18 4 2.397 9.253 5.257 27.07 5 2.417 9.365 5.219 26.36 6 2.485 9.516 5.290 27.77 平均值 2.419 9.324 5.255 27.24 CV% 1.7 1.9 1.6 3.1 2.5准确度验证 分别取处理后且已知浓度己低、高两个浓度的质控样品， 25-OHD，即 LQC(2.439 ng/mL)、HQC(9.367 ng/mL)，25-OHD，即 LQC=5.297 ng/mL、HQC=26.28 ng/mL。样品经分析后，数据统计分析得到准确度(%)结果如表7-8所示。 表7725-OHD，(ng/mL)准确度验证结果 LQC 靶值 准确度 HQC 靶值 准确度 QC-1 2.364 2.439 96.9% 9.159 9.367 97.8% QC-2 2.415 2.439 99.0% 9.541 9.367 101.9% QC-3 2.435 2.439 99.8% 9.111 9.367 97.3% QC-4 2.397 2.439 98.3% 9.253 9.367 98.8% QC-5 2.417 2.439 99.1% 9.365 9.367 100.0% QC-6 2.485 2.439 101.9% 9.516 9.367 101.6% 平均值 2.419 2.439 99.2% 9.324 9.367 99.5% 表8 25-OHD，(ng/mL)准确度正证结果 LQC 靶值 准确度 HQC 靶值 准确度 QC-1 5.249 5.297 99.1% 28.09 26.28 106.9% QC-2 5.384 5.297 101.6% 28.00 26.28 106.5% QC-3 5.133 5.297 96.9% 26.18 26.28 99.6% QC-4 5.257 5.297 99.2% 27.07 26.28 103.0% QC-5 5.219 5.297 98.5% 26.36 26.28 100.3% QC-6 5.290 5.297 99.9% 27.77 26.28 105.7% 平均值 5.255 5.297 99.2% 27.24 26.28 103.7% 2.6临床样品测定结果 共获取已证明为25-羟基维生素D含量正常的人血清样品8个，经前处理后分别进行测定，结果如表13所示。一般正常人体内25-羟基维生素D 的总含量范围为 10-60 ng/mL，各临床样品测定数值均在正常范围内，故该方法适用于临床血清样品中25-羟基维生素D含量准确定量。 表9人血清临床样品检测结果 编号 25-OHD2 (ng/mL) 25-OHD3 (ng/mL) 总计 (ng/mL) Sample-1 1.459 52.64 54.10 Sample-2 4.290 5.466 9.756 Sample-3 1.596 16.48 18.07 Sample-4 0.9190 32.23 33.14 Sample-5 0.2120 25.69 25.90 Sample-6 1.336 23.73 25.06 Sample-7 0.3580 21.02 21.38 Sample-8 0.9820 15.05 16.03 结论 本文使用岛津 Nexera MX System 平行液相系统和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045联用技术，建立了2分钟内超快速定量检测人血清中25-羟基维生素D，/D，的方法，并依据临床检验相关指导原则完成了方法法验证。实验结果表明，该方法对血清中25-羟基维生素 Dz/D，测定的可报告范围分别为为 0.3900-50.00 ng/mL、1.172-150.0 ng/mL； 精密度(CV%)分别为1.6-3.1%，准确度范围分别为96.9-106.9%。该技术通过巧妙且合理的设计，使得该检测方法不仅分析速度快、稳定性和准确度好，而且提高了约3倍分析效率，大大节省了临床实验室仪器采购与检测成本，，十分适用于相关医学检验实验室大批量人血清样品中25-羟基维生素 D，/D，的定量分析，该技术有望成为一种在医学检验领域备受青睐且广泛应用的液相色谱质谱联用技术，创造更多的社会价值。 本文使用岛津Nexra MX System平行液相系统和三重四极杆质谱仪LCMS-8045联用，建立了血清中25-羟基维生素D2/D3的定量检测方法，并依据临床检验相关指导原则完成了方法学验证。实验结果表明，该方法对血清中25-羟基维生素D2/D3测定的可报告范围分别为为0.5 - 50 ng/mL、1.25 – 160 ng/mL；日内和日间精密度（CV%）分别为1.6 - 3.1%、1.8 - 3.8%，批内批间准确度范围分别为96.9 - 106.9%、95.3 – 112.7% 。该方法分析速度快、稳定性和准确度好，且大大提高了分析效率，节省仪器采购与检测成本，适用于血清中25-羟基维生素D2/D3的定量分析，能够为临床检验行业的从业人员提供参考。