Fast GPC净化柱和EZsep™C18固相萃取柱在羊肉硝基咪唑检测方法中的应用

Fast GPC净化柱和EZsepTMC18固相萃取柱在羊肉硝基咪唑检测方法中的应用 动物源食品中的兽药残留超标，不仅易引发人体产生急性或慢性中毒，同时也会导致病原体耐药性增强，从而对人类健康构成威胁。因此，做好动物源性食品中兽药残留的检测具有重要意义。硝基咪唑类药物是一类常用抗菌类药物，常见的有甲硝唑、洛硝哒唑、地美硝唑、替硝唑、羟甲基甲硝咪唑等，使用此类药物对动物体重还具有增加作用，因此在畜禽养殖中被广泛违法使用。有研究表明，硝基咪唑类药物和其代谢物具有致突变和致癌性，禽类肉和蛋制品中的硝基咪唑类药物残留对消费者健康也构成直接威胁。 本实验参考《GB/T 21318-2007动物源食品中硝基咪唑残留量检验方法》，利用Fast GPC S-X3不锈钢凝胶净化柱(乙酸乙酯：环乙烷=1：1，20×300mm，货号：Y020207015) 和EZsepTMC18固相萃取柱(1g/6mL，货号：PZ10304) 进行样品净化，建立了一种羊肉中的硝基咪唑的检测方法，此方法的回收率及平行性良好，适用于动物源食品中硝基咪唑残留量的检测。 关键词： 硝基咪唑，固相萃取，凝胶净化 01 实验过程 1.1仪器与试剂 GPC1000全自动凝胶净化系统，北京莱伯泰科仪器股份有限公司； MVP全自动高通量真空平行浓缩仪，北京莱伯泰科仪器股份有限公司； Extrapid固相萃取装置，货号：C020019，北京莱伯帕兹检测科技有限公司；液质联用仪： SCIEX 4500， SCIEX公司； 甲醇(色谱纯)，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司； 乙酸乙酯(色谱纯)，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司； 丙酮(色谱纯)，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司； 环己烷(色谱纯)，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；甲酸(色谱纯)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 氯化钠(分析纯)，购自国药集团化学试剂有限公司； 硅藻土(分析纯)，购自国药集团化学试剂有限公司； EZsepTMC18固相萃取柱(1g/6mL， 货号： PZ10304)，北京莱伯帕兹检测科技有限公司； FastGPC S-X3不锈钢凝胶净化柱(20×300 mm， 货号： Y020207015)，北京莱伯帕兹检测科技有限公司。 1.2工作液配制 10种硝基咪唑标准使用液：10ug/mL， 溶剂为甲醇，购自坛墨质检标准物质中心。 标准工作液：取1mL10种硝基咪唑标准使用液加入10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配置成1ug/mL标准工作液。 取6份阴性样品溶液，按照最终定容浓度0、10、20、50、100、500ng/mL分别加入10种硝基咪唑1ug/mL标准工作液，制备成标准工作溶液。 1.3实验部分 1.3.1样品制备 精密称取市售羊肉20 g， 加入10g硅藻土，混匀，再加入5mL饱和氯化钠水溶液和7mL甲醇-丙酮(3+1)，均质3 min， 后续在 10000r/min条件下离心2min， 收集上清液，样品残渣用50mL甲醇-丙酮(3+1)重复提取两次，合并提取液。将提取液置于MVP全自动高通量真空平行浓缩仪上，按温度38℃、转速150rpm、真空度120mbar浓缩至仅剩水相，加入50 mL饱和氯化钠水溶液和25mL乙酸乙酯，振摇3 min， 分层后收集乙酸乙酯相，水相再用20mL乙酸乙酯重复提取两次，合并乙酸乙酯提取液，经无水硫酸钠除水，于MVP全自动高通量真空平行浓缩仪上按温度36℃、转速150rpm、真空度250mbar浓缩近干，用乙酸乙酯-环己烷(1+1)定容至5 mL， 待净化。 1.3.2凝胶净化 凝胶净化柱采用Fast GPC S-X3不锈钢凝胶净化柱(乙酸乙酯：环乙烷=1：1， 20×300 mm， 货号：Y020207015)；流动相采用乙酸乙酯-环己烷(1+1)；以5mL/min流速对1.3.1待净化液进行净化，收集10~20min的流出液，置于MVP全自动高通量真空平行浓缩仪，按温度 36℃、转速150rpm、真空度250mbar进行浓缩近干，用甲醇定容至5 mL， 待净化。 1.3.3固相萃取净化 EZsepTMC18固相萃取柱 (1g/6mL，货号：PZ10304)，用5mL甲醇进行活化，取1.3.2待净化液上样收集流出液，上样结束后用10mL甲醇洗脱萃取柱，收集全部洗脱液。将收集液置于MVP全自动高通量真空平行浓缩仪上，按温度38℃、转速150rpm、真空度120mbar浓缩近干，用甲醇定容至1 mL， 经0.22u滤膜过滤后，待上机检测。 1.3.4 LC-MS/MS测定条件 色谱柱： Shim-pack Velox C18 (2.7um， 2.1*100mm)； 柱温：40℃； 进样量：5uL； 离子源参数：IS电压：5500V，离子源温度TEM： 600℃； 检测方式：正离子模式，多反应监测(MRM)； 流动相： A：0.1%甲酸水溶液， B：甲醇； 流速：0.40mL/min。 表1流动相梯度洗脱表 表1流动相梯度洗脱表 时间 流动相A 流动相B 0 90 10 3.50 70 30 4.50 70 30 6.40 25 75 6.50 5 95 8.20 5 95 8.21 90 10 9.50 90 10 02 实验结果 T 图2羊肉样品 LC-MS/MS 色谱图 03 结论 本次实验展示了使用Fast GPC S-X3不锈钢凝胶净化柱(乙酸乙酯：环乙烷=1：1， 20×300 mm， 货号：Y020207015)和EZsepTMC18固相萃取柱(1g/6mL， 货号：PZ10304)，对羊肉中的10种硝基咪唑进行净化，通过LC-MS/MS进行测定，其加标回收率在71.3%-93.8%之间， RSD在1.4%-10.7%之间，能够满足标准要求。说明Fast GPC S-X3不锈钢凝胶净化柱(乙酸乙酯：环乙烷=1：1，20×300mm， 货号：Y020207015) 和EZsepTMC18固相萃取柱(1g/6mL， 货号：PZ10304)能很好的完成方法中的净化工作，并且结果稳定、可靠。 04 参考文献 1.GB/T 21318-2007 动物源食品中硝基咪唑残留量检验方法 化合物 加标浓度 加标回收率/% 均值% RSD% 1 2 3 4 5 6 4-硝基咪唑 1 92.7 95.2 89.5 88 79.8 82.3 87.9 6.8 异丙硝唑 1 79.8 96.7 91.6 96.9 82.1 84.5 88.6 8.4 甲硝唑 1 78.6 74.7 72.4 7 羟基化甲硝咪唑 1 80.4 92.9 77.7 10.7 氯甲硝咪唑 1 92.3 91.9 84.8 98 5.7 地美硝唑 1 90.7 76.4 96 94 10.1 HMMNI 1 82.8 86.5 84.8 2-甲硝咪唑 1 86 89.3 86.7 洛硝哒唑 1 87.1 94 100.4 87.1 苯硝咪唑 1 99 86.4 92.8 97.6 4-硝基咪唑 4 81.9 81.2 91 异丙硝唑 4 94.1 甲硝唑 4 83.5 83 羟基化甲硝咪唑 4 83.2 81.8 氯甲硝咪唑 4 83 87.3 77.4 地美硝唑 4 86.9 79.5 81 6 HMMNI 4 85.2 88.3 76.6 2-甲硝咪唑 4 98.4 89.2 9.1 洛硝哒唑 4 83.4 83 85.3 82.9 81.7 83.2 83.2 1.4 苯硝咪唑 4 66.8 76.4 64.4 78.3 67.7 74.1 71.3 8