采用液相色谱-质谱联用法测定婴儿配方奶粉中的脂溶性维生素

建立了LC-MS/MS法定量测定婴儿配方奶粉中脂溶性维生素（维生素A1、D3、E和K1）的方法。采用固相支撑液液萃取（SLE）法制备样品。在10-400 ng/mL范围内，R2>0.999，线性良好。QC样品（FAPAS）的分析结果证实，在不使用内标物的情况下，此方法的准确度和精密度也均在可接受的范围。ApplicationNews 岛津SHIMADZUhttp：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439400-650-0439 ApplicationNews 脂溶性维生素/LCMS-8045 固相支撑液液萃取 (SLE) 结合LC-MS/MS 法定量测定婴儿配方奶粉中脂溶性维生素 04-ad-0265-CN Lai Kit Yee， Xin Jie， Zhaoqi Zhan'岛津新加坡 特点描述 ◆建立了固相支撑液液萃取(SLE)的样品制备方法，采用 LCMS-8045 定量测定婴儿配方奶粉中的脂溶性维生素(A1、D3、E和K1)。◆通过分析 FAPAS QC 质控样品中的脂溶性维生素，验证并确认了此方法的可靠性。分析结果表明该方法的准确度和精密度均在可接受范围。 简介 脂溶性维生素分为四类：维生素A、D、E和K， 它们在人体具有重要作用，如视觉功能(维生素A)、钙吸收(维生素D)、细胞膜抗氧化(维生素E)、凝血功能(维生素K)等方面。婴儿配方奶粉作为婴儿的主要食物来源，必须能够提供足够的维生素。由于萃取过程中脂溶性维生素的复杂性和不稳定性，其定量仍然具有挑战性。因此，萃取是测定牛奶样品中脂溶性维生素的关键步骤。[1]在本应用报告中，采用固相支撑液液萃取 (SLE)技术，结合MRM 定量的方法，采用 LCMS-8045(配置APCI离子源)定量测定婴儿配方奶粉中的脂溶性维生素。 *FAPAS：“判定食品检测分析实验室能力的评估体系”，由英国食品和环境研究机构组织的食品和水检测的能力验证。 实验部分 试剂和标准品 视黄醇、邻苯三酚、氢氧化钾和丁羟甲苯购自 Sigma-Aldrich。脂溶性维生素试剂盒(含维生素D3、维生素E和维生素K1)购自 AccuStandard。己烷和乙醇使用 HPLC 级试济。在由LCMS 级甲醇和 Milli-Q水制备的流动相中，使用 LCMS级甲酸作为添加剂。 LC-MS/MS条件 LCMS-8045 的分析条件见表1。 4种化合物的 MRM参数(定量离子和参比离子)及优化的碰撞能(CE) 见表2。 表 1 LCMS-8045 的分析条件 LC条件 (Nexera) 色谱柱 Shim-pack GIST C18 column (2.1x100 mm， 3 um) P/N： 227-30008-05 流速 0.4 mL/min 流动相 A： 0.1%甲酸的 Mili-Q水溶液 B： 0.1%甲酸甲醇溶液 LC 程序 梯度洗脱， 15 min 柱箱温度 40°C 进样量 10 pL 梯度程序 B%： 80%(0.5 min)→100% (5-12 min)→80%(12.01-15 min) MS 条件 (LCMS-8045) 接口 APCI 接口温度 350°C DL 温度 250°C 加热模块温度 200°C 雾化气 3 L/min 干燥气流量 5 L/min 模式 MRM， 正离子模式 表 2 MRM 参数和优化的CE 名称 定量离子 CE (V) 参比离子 CE(V) 维生素A1 269.3>92.9 -24 269.3>107.2 -18 维生素 D3 385.4>259.1 -14 385.4>367.2 -11 维生素E 431.5>165.2 -21 431.5>137.3 -43 维生素K1 451.5>187.1 -25 451.5>57.2 -35 ( 样品处理 ) 样品制备流程见图1。按照流程制备质控样品。 将样品上样至 SLE 柱前， 调节 pH值很重要，因为其将影响脂溶性维生素在柱中的保留。实验结果表明，样品 pH 值在6-7左右时，脂溶性维生素有良好的回收率。 结果和讨论 LC-MS/MS 条件优化 在 APCI 正离子模式下，对4种非极性脂溶性维生素进行MRM 优化。使用 C18色谱柱对脂溶性维生素进行分离。将流动相B的初始百分比设定为80%，以缩短总分析时间并获得更尖锐的色谱峰。纯溶剂中 50 ng/mL 的混合标准溶液 MRM色谱图见图2。 图1采用固相支撑液液萃取(SLE)法制备婴儿配方奶粉样品流程图 图2 50 ng/mL混合标准溶液的MRM色谱图 校准曲线和灵敏度 使用 10-400 ng/mL的混合标谁溶液建拉校准曲线(图3)。所有维生素均获得良好的线性关系， R'值大于0.999。通过连续6次进样50 ng/mL混合标准溶液来评价重复性。线性、LOD、LOQ 和 %RSD 结果见表3。 表3脂溶性维生素的线性、LOD、LOQ 和%RSD 维生素 RT (min) R2 LOD LOQ %RSD 峰面积 %RSD RT (ng/mL) (ng/mL) (n=6) (n=6) A1 4.090 0.9998 2.8 8.5 0.44 0.22 D3 6.499 0.9997 2.1 6.3 3.41 0.06 E 7.025 0.9998 1.6 4.8 0.73 0.03 K1 8.561 0.9998 2.5 7.4 2.05 0.02 图3维生素A1、D3、E和K1在10-600 ng/mL范围内的校准曲线 质控样品(QCM) 的测定 应用所建立的方法对 FAPAS 质控样品 (T21125QC)进行分析[3]，以确定方法的可靠性。对QC 样品进行了6次独立分析。QC样品的分析结果总结见表4。6次分析结果的%RSD 小于10%，表明此方法的精密度可接受。 表4QC样品 (T21125QC)6次分析结果 样品 A1 D3 E K1 (pg/100g) (ug/100g) (ug/100g) (ug/100g) QC1 436.8 10.2 22.1 31.4 QC2 450.0 9.7 22.1 33.0 QC3 444.1 9.1 21.3 39.4 QC4 436.7 8.9 21.6 36.0 QC5 468.3 9.3 22.6 37.4 QC6 455.7 8.7 21.9 36.0 %RSD 2.3 4.8 1.7 6.9 6次分析的定量结果均在QC样品的可接受范围内。6次分析的平均浓度、赋值及其可接受范围见表5。 建立了 LC-MS/MS法定量测定婴儿配方奶粉中脂溶性维生素(维生素A1、D3、E和K1)的方法。采用固相支撑液液萃取(SLE)法制备样品。在10-400 ng/mL 范围内， R²>0.999，线性良好。QC样品(FAPAS)的分析结果证实，在不使用内标物的情况下，此方法的准确度和精密度也均在可接受的范围。 ( ：参考文献 ) ( 1 . E . Karrar， Isam A.Mohamed Ahmed， M. F . Manzoor，W.W. ， F.Sarpong， X.Wang， Food Chemistry 373 (2022)131436 ) ( 2. Y.L Chew， Shimadzu Appl . News AD-0208 ) ( 3 . FAPAS QC Material Data Sheet (T21125QC) ) ( 致谢 ) 我们要感谢 Teh Bo Yan 在岛津实习期间参与了这项工作。 图4QC样品中维生素A1、D3、E和K1的MRM色谱图 评价了方法的日间重复性。保留时间和浓度的%RSD 见表6。维生素A1 和维生素E浓度的日间重复性小于10%，维生素D3和维生素K1 浓度的日间重复性小于15%。 表 6 QC样品T21125QC (n=6x2天)中维生素A1、D3、E和K1的RT和浓度的日间%RSD 维生素 平均浓度， ug/100g %RSD， RT %RSD， 浓度 A1 437.9 0.33 3.5 D3 10.0 0.09 10.8 E 21.8 0.09 3.6 K1 38.0 0.11 14.9 岛津应用云 Nexera 和 Shim-pack 是株式会社岛津制作所在日本和其他国家的商标。 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ( 免责声明： ) ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 如有变动，恕不另行通知。 )