婴幼儿配方营养品中全反式和13- 顺式维生素A 和E检测方案(液相色谱仪)

样品溶液制备 结果与讨论 引言 维生素A为环己烯加共轭多烯结构(结构见图1)，多以棕榈酸酯或醋酸酯形式强化到婴幼儿或成人配方营养品中，且绝大多数是以天然全反式 (all-trans)异构体存在，但在加热或理化因素的作用下，会产生各种顺式异构体，其中13-顺式(13-cis)是最普遍和主要的活性异构体(活性约为 trans 的75%")，其他异构体效价各不相同，因此建立维生素A异构体的分离分析方法，对于科学评价维生素A的活性具有重要意义。高效液相色谱法是分析维生素A和E的常用方法，我国关于食品中维生素A的标准方法中，采用C18柱反相色谱法进行测定，该法无法将维生素A的异构体分开，实际测定结果为VA醇的总含量。 本文采用在线二维色谱分离法，A9一维和二维分离均基于反相色谱，样品经过皂化、萃取后，直接进样分析，样品净化在线完成，，一次进样完成 all-trans 和 13-cis 维生素A和α-维生素E的测定，提高了方法的准确性和样品分析效率。 图1.维生素A结构 仪器和软件 硬件： UltiMate DGP 3600 系列，包括带有在线脱气单元的双三元梯度泵；带有1个两位置六通阀和1个两位置十通阀的柱温箱；E；二极管阵列检测器(DAD)，500微升不锈钢定量环。 软件：Thermo Scientific DionexM ChromeleonM ChromatographyData System (CDS) software， version 7.2。 全反式维生素 A (all-trans retinol， > 95%， Acros Organics)、维生素 E (ax-tocopherol， ≥96%， Sigma， HPLC)。 氢氧化钾(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，乙腈、甲醇(色谱级， Fisher公司)，去离子水(18.2MQ， Millipore纯水机)，抗坏血酸(≥95%，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，婴幼儿配方奶粉(市售)o 参考GB5413.9-20105的方法，精密称取奶粉10g(液态奶50mL)，于250mL锥形瓶中，加入30mL热水使溶解(液态奶不需加入)，再加入15 g/L 的维生素C乙醇溶液100mL， 再加入1.25 g/mL 的氢氧化钾溶液25mL， 磁力搅拌45分钟，温度60±2℃。将皂化液转移至500mL分液漏斗中，以石油醚萃取3次(出现乳化，可加饱和的氯化钠溶液破乳)，每次100mL，合并萃取液，萃取液以水洗涤至偏中性(pH试纸测试)，收集石油醚层，经过无水硫酸钠脱水。低温减压回收石油醚，至1~2mL时转移至10mL棕色瓶中，氮气吹干，再以3~5 mL甲醇使溶解并转移至 10 mL 棕色量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，待用。未用完溶液放入4℃冰箱保存。 测试条件 一维色谱条件： 色谱柱： Acclaim 120 C8， 120A， 2.1×100 mm×3 pm(P/N：059123) 流速： 0.4mL/min 流动相：A，乙腈；B，甲醇；C，水，梯度程序见表1.。二维色谱条件： 色谱柱： Acclaim C30， 3×150 mm×3 pm (P/N： 075724) 流速：0.5mL/min 流动相：A，乙腈；B，甲醇；C，水，梯度程序见表1.。 柱温：30℃ 检测波长：325nm，296 nm 进样体积：5pL 系统连接见图2，阀切换过程见表2.。 图2.全自动在线二维柱切换系统流路示意图 表1.一维分离和二维分离梯度程序 一维分析泵 二维分析泵 时间(分钟) A% B% C% 时间(分钟) A% B% C% 0 50 0 50 0 5 0 95 2 50 0 50 13 5 0 95 15 100 0 0 15 50 10 40 20 0 100 0 25 70 10 20 27 50 50 0 35 70 10 20 28 50 0 50 40 100 0 0 表2.阀切换时间及过程 时间 左阀 右阀 说明 0 6_1 1_2 UV与一维色谱柱连接，分析总的 vitamins A 和E 10.5 6_1 10_1 UV与一维色谱连接，将含有 vitaminA的洗脱物切割至 LOOP中 11.1 6_1 1 2 UV与一维色谱柱连接，含有 Vitamin A 的洗脱物转移完成，二维流动相将 loop中目标物转移至二维色谱柱中。 13.1 6_1 10_1 19 1_2 10_1 UV 与二维色谱柱连接，二维色谱分离 13-cis 和 all trans-vitamin A 38 6-1 1-2 分析完成，阀切换到初始状态 标准品和样品分离谱图 图3. Vitamins A 和E混合标准品分析谱图(A为全图，B为放大谱图) 图4.雀巢婴幼儿配方奶粉分离谱图(其中A为全图，B为放大大图) 图5.贝因美婴幼儿配方奶粉分离谱图(A为全图，B为放大谱图) 实验基于二维色谱分离方法，建立了婴幼儿配方营养品中 13-cis 和 all-trans vitamin A 和 vitamin E 的分析方法。本文针对二维色谱分离体系中的一维和二维色谱柱进行了考察，应用C30色谱柱可以将 13-cis 和 all-trans vitaminA 同其他的顺反异构体达到基线分离(见图5)。另外本文对系统连接进行了优化设计，，一次进样即可实现 vitamins A 和E的同时定量，又可根据一维目标物保留时间的变化，灵活做出切割时间窗口的调整，保证目标物100%的从一维色谱柱转移至二维色谱柱中，避免柱切换过程中的损失。应用上述构建的二维系统和色谱条件，一维C8色谱柱可实现维生素E的定量和总维生素A的初步分离，二维 C30色谱柱可实现对 Vitamin A 异构体的分离。 图7.维生素A各异构体混合物在C30色谱柱上分离谱图 ( 参考文献 ) ( [1] Adrienne McMahon， Scott C h ristiansen， L ynsey S hine， Calvin Loi， Dawn owell. Simultaneous Det e rmination of 13-cis and all- trans V itamin A Palmitate (Retinyl Palmitate)， Vi t amin A Ace t ate(Retinyl Acetate)， and T otal Vitamin E (a-Tocopherol and DL - a- ) ( Tocopherol Acetate) in I nfant Formula and Adult N u tritionals byNormal Phase H PLC. Jo urnal of AOAC International，2013，96(5) ： 1 073 ) ( [2] GB 5413.9-2010，婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E 的测定，食品安全国家标准 ) SCIENTIFIC SCIENTIFICAN_C_LC-       维生素A 为环己烯加共轭多烯结构（结构见图1），多以棕榈酸酯或醋酸酯形式强化到婴幼儿或成人配方营养品中，且绝大多数是以天然全反式（all-trans）异构体存在，但在加热或理化因素的作用下，会产生各种顺式异构体，其中13- 顺式（13-cis）是最普遍和主要的活性异构体（活性约为trans 的75%[1]），其他异构体效价各不相同，因此建立维生素A 异构体的分离分析方法，对于科学评价维生素A 的活性具有重要意义。高效液相色谱法是分析维生素A 和E 的常用方法，我国[2] 关于食品中维生素A的标准方法中，采用C18 柱反相色谱法进行测定，该法无法将维生素A 的异构体分开，实际测定结果为VA 醇的总含量。