LC-MS/MS法分析调味品中去甲乌药碱

本实验使用岛津LCMS-8045液质联用系统，开发了调味品中去甲乌药碱含量的检测方法。实验结果表明，在0.1~2 μg/mL范围内，线性良好，相关系数R均>0.999；0.5 μg/mL去甲乌药碱保留时间RSD为0.1%，峰面积RSD为1.4%；去甲乌药碱的检出限、定量限分别为0.3 μg/g、1 μg/g，满足法规要求。SSL-CA22-553Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-732 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS 法分析调味品中去甲乌药碱 LCMSMS-732 摘要：采用岛津三重四极杆液质联用仪，建立了调料中去甲乌药碱的定性定量方法。调味品经酸性甲醇提取，反相色谱分离，三重四极杆质谱法测定。结果显示该方法在0.1~2 ug/mL范围内，线性良好，相关系数R均>0.999； 0.5 ug/mL去甲乌药碱保留时间 RSD 为 0.1%，峰面积RSD 为1.4%；去甲乌药碱的检出限、定量限分别为 0.3 ug/g、1ug/g。该方法分析速度快，灵敏度高，适用于调味品中去甲乌药碱含量测定。 关键词：三重四极杆液质联用仪去甲乌药碱调味品兴奋剂 技术特点： 心分析速度快，6分钟即可实现去甲乌药碱定性定量测定。 去甲乌药碱 (Higenamine)，是一种喹啉类生物碱，能增强心肌收缩力，加快心率扩张，对慢性心脑血管有改善作用，在附子、细辛、干荷叶、干莲子、山药、玉竹、花椒、桂皮等均有广泛分布。2017年，世界反兴奋剂中心(WADA) 发布了《禁用清单》，去甲乌药碱属于S3类B2激动剂类兴奋剂，禁止运动员在所有场合使用去甲乌药碱。由于去甲乌药碱广泛分布在多种植物中，已有报道，食品、营养品、药品和化妆品中检测出去甲乌药碱。因此，国家体育总局发布了《大型赛事食源性兴奋剂防控指南》，发布了去甲乌药碱阳性的风险防控 指南，并提供了含去甲乌药碱的药品清单，共408种。此外含波叶青牛胆、附子、乌头、乌药、细辛、莲子、莲子心、释迦的药品、营养品和食品也应当禁用。指南规定，去甲乌药碱的检出限10 ug/kg。 目前，去甲乌药碱的检测方法以的检测方法以液相色谱-串联质谱法A、S气相色谱-质谱联用法为主，尚未见相关检测标准。本文建立了去甲乌药碱的液相色谱-串联质谱测定方法。该方法快速、准确、灵敏度高，供相关行业参考。 实验部分 1.1仪器配置 岛津超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪联用系统LCMS-8045。具体配置为 输 液 泵：LC-40D XR×2 系 统控制器号：： CBM-40 自动进样器：SIL-40C XR 三重四极杆质谱仪专：LCMS-8045 柱 温 箱：CTO-40C 色谱工作 站： LabSolutions Ver. 5.113 1.2分析条件 液相色谱条件 色 谱 柱：：Shim-pack GISS-HP (100 mmx2.1 mml.D.， 3 um) 岛津(上海)实验器材有限公司， P/N：227-30084-02 流动 相： A相-0.1%甲酸5mM乙酸铵水溶液； B相-甲醇 表1 梯度洗脱时间程序 流速：0.3mL/min 柱 温温：40°C 洗脱方式：：梯度洗脱，B相初始浓度为20%，时间程序见表1。 进 样 量量： 0.5pL 洗针模式：：水：甲醇((1：1) Time(min) Module Command Value 2.00 Pumps Pump B Conc. 30 3.00 Pumps Pump B Conc. 80 4.00 Pumps Pump B Conc. 20 6.00 Controller Stop 质谱条件 质谱仪： LCMS-8045 离子子源： ESI+(1.0kV)雾化气：氮气3 L/min干 燥 气 氮气5L/min 加热气：空气 15L/min 脱溶剂管温度： 150℃加热模块温度： 400℃接口温度：400°℃扫描模式：MRMMRM参 数：见表2 表2 MRM 参数 序号 中文名 前体离子(m/z) 产物离(m/z) CE (V) 1 去甲乌药碱 107.00* -25 272.00 161.00 -17 255.00 -15 定量离子对 1.3样品前处理 准确称取 0.5g花椒粉末，加入50.0 mL甲醇(含0.1%甲酸)，13500 rpm 均质30s， 超声提取5 min，4000 rpm 离心 10 min， 取上清液，过 0.22 um滤膜，上机测定。 1.4标准溶液制备 标准系列工作液的酒制：取母液适量，配制成浓度为0.1、0.2、0.5、1、2 ug/mL的标准工作曲线，待上机分析。 ■结果与讨论 2.1质谱条件优化 去甲乌药碱含有酚羟基和N杂环，在正负模式均有电离，正离子模式[M+H]* m/z 272.05，负离子模式[M-H]m/z 270.15，综合考虑色谱分离及电离影响，选择ESI+模式，正离子模式 m/z 272.05二级质谱图，如下图1所示。示，加热气 15 L/min、接口温度400℃、DL温度150℃、干燥气5L/min、接口电压为 1.0 kV时响应强度更高，是默认参数的3倍。 图1 去甲乌药碱二级质谱图 (CE=-15eV) 2.2前处理考察 本文对 dSPE (含无水硫酸镁1200 mg， N-丙基乙二胺 300 mg，十八烷基硅烷键合硅胶 100 mg)、HLB两种净化方式进行了考察，结果显示，去甲乌药碱与通道干扰分离良好，净化对基质效应没有改善，净化前后响应强度没有明显改变。建议有条件时使用 HLB模式净化，以减缓质谱污染。 图2 5 ng/mL 基质加标样品的 MRM 色谱图 2.3线性及灵敏度 按照1.4方法配制标准系列溶液，上机分析得出去甲乌药碱线性范围和线性关系。结果表明，去甲乌药碱在0.1~2 ug/mL范围内，线性良好，相关系数R均>0.999，准确度88.7%~102.9%之间。去甲乌药碱校准曲线见图3。根据信噪比，计算其检出限 (S/N=3)和定量限(S/N=10)分别为 0.3 ug/g 和1ug/g。 图3去甲乌药碱校准曲线 2.4精密度考察 0.5 ug/mL的标准溶液，注入液相色谱串联质谱仪，平行测定6次，计算保留时间(R.T.) 和峰面积 (Area) 的RSD%。结果显示，去甲乌药碱保留时间 RSD 为 0.1%， 峰面积 RSD 为 1.4%，实验结果表明仪器条件稳定性良好。 2.5实际样品含量测定 由于去甲乌药碱是内源性成分，无法获得不含待测成分的空白基质，本文采用标准添加法测定含量。向样品1提取液中加入一定量的去甲乌药碱母液，使加标浓度为 0.5 ug/mL，根据单点外标法，计算出样品1加标前的浓度， 574004/826180*0.5 ug/mL=0.35 ug/mL； 同时根据加标前后的浓度差值，计算出定量准确度为 (0.94-0.35)/0.5*100%=119%。 表3 样品测定结果 测试 液标0.5 ug/mL 样品1 样品 1+0.5 ug/mL 样品1 样品1+0.5 ug/mL 面积 面积 面积 浓度 ug/mL 浓度 ug/mL 平行1 837，631 568，377 1，539，714 0.34 0.92 平行2 814，729 579，631 1，574，532 0.36 0.97 平均值 826，180 574，004 1，557，123 0.35 0.94 结论 本实验使用岛津 LCMS-8045 液质联用系统，开发了调味品中去甲乌药碱含量的检测方法。实验结果表明，在 0.1~2 ug/mL 范围内，线性良好，相关系数R均>0.999； 0.5 ug/mL 去甲乌药碱保留时间 RSD 为 0.1%， 峰面积 RSD 为 1.4%；去甲乌药碱的检出限、定量限分别为 0.3 ug/g、1ug/g， 满足法规要求。 岛津应用云