人血浆中酪氨酸酶抑制剂类抗肿瘤药物含量检测方案(液质联用仪)

SSL-CA22-186Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-655 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS 检测人血浆中15种酪氨酸酶抑制剂类抗肿瘤药物含量 LCMSMS-655 摘要：本文建立了一种使用岛津液相色谱质谱联用仪内标法测定人血浆中15种酪氨酸酶抑制剂类抗肿瘤药物含量分析方法。血浆样品经含同位素内标物的甲醇进行蛋白沉淀后，取上清加水稀释后即可进样分析，一针进样，5分钟即可完成15种酪氨酸激酶抑制剂 (TKIs)抗肿瘤药物分析，分别考察了方法的线性、准确度和精密度性能。结果显示各分析物线性范围内标准曲线相关系数均大于0.999， 方法准确度在90%~110%之间，精密度 RSD 均在 0.9%~9.36%之间，可满足临床日常检验需求。该方法分析速度快，灵敏度高，， 专属性强，前处理简单，可为相关从业人员提供参考。 关键词： LC-MS/MS酪氨酸激酶抑制剂 抗肿瘤 根据世界卫生组织的数据，2012年全球新增癌症病例1410万例，癌症死亡820万例，癌症患者3260万。乳腺癌、肺癌和结直肠癌是女性死亡率最高的癌症，而肺癌、肝癌和胃癌是男性死亡率最高的癌症。癌症是全球第二大死因，在几个发达国家甚至是第一大死因。 酪氨酸激酶抑制剂 (TKIs))E的研究始于2000年代初。自从2001年第一个 TKI 伊马替尼应用于慢性髓系白血病的治疗以来，到2020年，FDA共批准52个TKIs用于治疗各种恶性肿瘤。尽管它们有效，但TKI药代动力学特征似乎没有引起足够重视。所有这些药物都是口服给药且仅以一个起始剂量给药，而有些药物显示出广泛的个体内部和个体间变异性。这种药代 动力学变异性导致患者之间的药物暴露高度不同，导致许多人血浆浓度过高或过低。其他因素也素降低 TKI的有效性，例如预后不良或其他临床因素、药效学因素(如受体突变)或缺乏依从性。考虑到疾病的严重预后、广泛的药代动力学变异性、长期使用和药物的高成本，治疗药物监测(TDM) 可能是帮助临床医生进行个体剂量调整的非常有用的工具，具有重要意义。 本文应用多项 TKIs 抗肿瘤药物测定试剂盒，使用岛津 LCMS-8045 CL 液相色谱三重四级杆质谱仪开发了其治疗药物监测方法。血浆样品经含同位素内标物的甲醇进行蛋白沉淀后，取上清青水稀释后即可进样分析，一针进样，5分钟即可完成15种TKIs抗肿瘤药物分析，该方法简易快捷，适合自动化及高通量检测分析。 1.1仪器 本实验使用岛津临床质谱 LCMS-8045CL， 具体配置如下： 输液泵：LC-40D XR CL检测器：LCMS-8045 CL自动进样器： SIL-40C XR CL柱温箱： CTO-40C CL系统控制器： CBM-40 CL工作站软件： LabSolutions LCMS CL Ver. 1.30 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack Scepter C18-120 (50 ×2.1 mm，3 pm)， SGLC， 货号：227-31014-03 流动相：A相-0.1%甲酸水5mM醋酸铵，B相-0.1%甲酸甲醇 洗脱方式： 梯度洗脱，B相初始浓度为25%。时间程序见表1 流速：0.4mL/min 进样器温度：8℃ 柱温：45℃ 进样量：5uL 表1 梯度洗脱程序 时间 (min) A(%) B ((%) 2.00 20 80 2.01 5 95 3.50 5 95 3.51 75 25 5.00 75 25 质谱条件 离子化模式：ESI+离子源温度：300℃加热气：空气10.0 L/minDL管温度：250℃雾化气：氮气3.0L/min加热模块温度：400℃干燥气：氮气10.0L/min扫描模式：多反应监测(MRM)驻留时间：：10 msMRM参数：见表2 表2化合物MRM 参数 # 化合物 英文名 CAS号 离子对 Q1 Pre CE Q3 Pre 伊马替尼 Imatinib 152459-95-5 494.10>217.20 -17 -25 -23 2 伊马替尼-d8 Imatinib-d8 1092942-82-9 502.10>394.20 -24 -28 -19 3 索拉非尼 Sorafenib 284461-73-0 465.10>252.20 -16 -34 -12 4 索拉非尼-d3 Sorafenib-d3 1130115-44-4 468.10>255.10 -16 -12 5 帕唑替尼 Pazopanib 444731-52-6 438.10>357.20 -15 -25 6 帕唑替尼-d3 Pazopanib-d3 N/A 441.10>360.20 -15 -25 7 拉帕替尼 Lapatinib 231277-92-2 581.10>350.10 -20 -37 -10 8 拉帕替尼-d4 Lapatinib-d4 1184263-99-7 585.10>365.10 -20 -37 -10 9 阿帕替尼 Apatinib 811803-05-1 398.20>212.20 -14 -27 -23 10 阿帕替尼-d8 Apatinib-d8 N/A 406.20>212.20 -14 -27 -23 11 吉非替尼 Gefitinib 184475-35-2 447.10>128.10 -10 -27 12 吉非替尼-d6 Gefitinib-d6 1228664-49-0 453.10>134.10 -10 -27 13 依鲁替尼 lbrutinib 936563-96-1 441.10>138.10 -15 -27 -29 14 依鲁替尼-d5 lbrutinib-d5 N/A 446.10>138.10 -15 -27 -29 15 达沙替尼 Dasatinib 302962-49-8 488.00>401.00 -17 -30 -19 16 达沙替尼-d8 Dasatinib-d8 302962-49-8 496.10>406.10 -17 -30 -19 17 克唑替尼 Crizotinib 877399-52-5 450.10>259.10 -15 -23 -27 18 克唑替尼-d5 Crizotinib-d5 1395950-84-1 455.10>264.20 -15 -23 -27 19 尼罗替尼 Nilotinib 641571-10-0 530.10>289.10 -24 -30 20 尼罗替尼-d6 Nilotinib-d6 1268356-17-7 536.10>295.10 -24 -30 21 厄洛替尼 Erlotinib 183321-74-6 394.10>278.00 -14 -29 22 厄洛替尼-d6 Erlotinib-d6 183319-69-9 400.10>278.00 -14 -29 23 鲁索替尼 Ruxolitinib 941678-49-5 307.10>186.10 -11 -27 -19 24 鲁索替尼 -d9 Ruxolitinib-d9 N/A 316.20>186.10 -11 -27 -19 25 普纳替尼 Ponatinib 943319-70-8 533.20>260.10 -36 -28 -18 26 普纳替尼-d8 Ponatinib-d8 N/A 541.20>260.10 -36 -28 -18 27 阿西替尼 Axitinib 319460-85-0 387.10>356.10 -14 -20 -26 28 阿西替尼-d4 Axitinib-d4 N/A 390.10>356.10 -14 -20 -26 29 N-去甲伊马替尼 N-YMTN 404844-02-6 480.10>203.10 -16 -25 -21 30 N-去甲伊马替尼-d8 N-YMTN-d8 N/A 488.10>211.10 -16 -25 -21 1.3样品配制和前处理 1.3.1样品配制 (1))将试剂盒(多项激酶抑制剂类抗肿瘤药物联合测定试剂盒，豪思生物)和血浆样品于冰箱取出后回复至室温。 (2)校准品及质控品配制：在室温下精密移取2mL超纯水至各水平校准品及质控品瓶中，轻微震荡，混合30-60分钟，使内容物完全溶解，冷藏备用。 表33校准品&质控品浓度信息 # 化合物 校准品(ng/mL) 质控品 (ng/mL) STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 LQC MQC HQC 1 伊马替尼 50 250 500 2500 5000 75 750 3750 2 尼罗替尼 50 250 500 2500 5000 75 750 3750 3 索拉非尼 50 250 500 2500 5000 75 750 3750 4 帕唑替尼 50 250 500 2500 5000 75 750 3750 5 拉帕替尼 50 250 500 2500 5000 75 750 3750 6 阿帕替尼 20 100 200 1000 2000 30 300 1500 7 吉非替尼 20 100 200 1000 2000 30 300 1500 8 依鲁替尼 20 100 200 1000 2000 30 300 1500 9 N-去甲伊马替尼 50 250 500 2500 5000 75 750 3750 10 克唑替尼 20 100 200 1000 2000 30 300 1500 11 达沙替尼 2 10 20 100 200 3 30 150 12 厄洛替尼 20 100 200 1000 2000 30 300 1500 13 鲁索替尼 20 100 200 1000 2000 30 300 1500 14 阿西替尼 1 5 10 50 100 1.5 15 75 15 普纳替尼 2 10 20 100 200 3 30 150 1.3.2样本前处理 (1)移取100pL校准品/质控品/待测血清样本于 1.5 mL离心管； (2)加入300 uL内标萃取液于2000 rpm 涡旋 2 min； 4℃下，10000 rpm 离心5 min； (3) 取100 uL 上清于进样小瓶并加入900 uL纯水混匀；进样5uL测定。 实验结果 2.1线性关系 将5个标准浓度的校准品按1.3.2中前处理条件进行分析测定，以浓度比为横坐标，面积比为纵坐标，内标法制作校准曲线得到相关系数、线性范围和校准品准确度见表 4。 图1 部分校准曲线 表4 校准曲线参数 # 化合物 相关系数 线性范围 (ng/mL) 准确度(%) 伊马替尼 0.99986 50-5000 93.3~104.9 2 索拉非尼 0.99998 50-5000 97.3~103.0 3 帕唑替尼 0.99983 50-5000 96.2~105.0 4 拉帕替尼 0.99964 50-5000 95.3~107.5 阿帕替尼 0.99971 20-2000 94.9~103.5 吉非替尼 0.99978 20-2000 94.2~105.7 7 依鲁替尼 0.99999 20-2000 97.5~101.3 8 达沙替尼 0.99991 2-200 92.9~108.4 9 克唑替尼 0.99921 20-2000 91.0~112.8 10 尼罗替尼 0.99997 50-5000 94.4~106.6 11 厄洛替尼 0.99994 20-2000 97.8~102.3 12 鲁索替尼 0.99990 20-2000 92.7~105.4 13 普纳替尼 0.99971 2-200 97.1~105.1 14 阿西替尼 0.99993 1-100 95.8~103.1 15 N-去甲伊马替尼 0.99933 50-5000 95.8~111.1 2.2精密度及准确度 本实验分别对低、中、高浓度质控品进行6次重复测定，精密度及准确度数据结果见表5至表7。方法准确度在90%~110%之间，精密度 RSD 均在 0.9%~9.36%之间，可满足临床日常检验需求。 表5 LQC精密度&准确度结果 (n=6) # 化合物 均值(ng/mL) %RSD 靶值(ng/mL) 准确度 伊马替尼 75.46 4.19 75 100.6% 2 索拉非尼 69.25 2.64 75 92.3% 3 帕唑替尼 77.25 1.64 75 103.0% 4 拉帕替尼 76.00 0.99 75 101.3% 5 阿帕替尼 30.35 1.10 30 101.2% 6 吉非替尼 29.48 3.46 30 98.3% 7 依鲁替尼 29.13 2.93 30 97.1% 8 达沙替尼 2.77 3.36 3 92.2% 9 克唑替尼 29.19 2.87 30 97.3% 10 尼罗替尼 73.14 0.90 75 97.5% 11 厄洛替尼 29.05 3.59 30 96.8% 12 鲁索替尼 28.24 3.32 30 94.1% 13 普纳替尼 3.12 7.93 3 104.0% 14 阿西替尼 1.52 5.93 2 101.5% 15 N-去甲伊马替尼 74.31 1.72 75 99.1% 表6MQC精密度&准确度结果(n=6) # 化合物 均值(ng/mL) %RSD 靶值(ng/mL) 准确度 伊马替尼 756.73 1.80 750 100.9% 索拉非尼 748.68 1.74 750 99.8% 3 帕唑替尼 714.77 2.41 750 95.3% 4 拉帕替尼 751.41 4.94 750 100.2% 5 阿帕替尼 288.90 3.42 300 96.3% 6 吉非替尼 314.41 4.60 300 104.8% 7 依鲁替尼 307.51 2.57 300 102.5% 8 达沙替尼 27.29 2.40 30 91.0% 9 克唑替尼 289.85 2.57 300 96.6% 10 尼罗替尼 802.90 5.04 750 107.1% 11 厄洛替尼 304.42 1.15 300 101.5% 12 鲁索替尼 300.22 6.53 300 100.1% 13 普纳替尼 27.70 4.10 30 92.3% 14 阿西替尼 14.80 2.56 15 98.6% 15 N-去甲伊马替尼 807.17 1.69 750 107.6% 表77HQC 精密度&准确度结果 (n=6) # 化合物 均匀(ng/mL) %RSD 靶值(ng/mL) 准确度 伊马替尼 3529.20 1.10 3750 94.1% 索拉非尼 3377.85 1.73 3750 90.1% 3 帕唑替尼 3573.19 1.59 3750 95.3% 4 拉帕替尼 3798.23 2.52 3750 101.3% 5 阿帕替尼 1440.93 2.27 1500 96.1% 6 吉非替尼 1447.90 2.07 1500 96.5% 7 依鲁替尼 1371.31 4.20 1500 91.4% 8 达沙替尼 139.16 8.48 150 92.8% 9 克唑替尼 1411.01 7.63 1500 94.1% 10 尼罗替尼 3503.83 4.12 3750 93.4% 厄洛替尼 1439.83 1.20 1500 96.0% 鲁索替尼 1352.30 1.68 1500 90.2% 13 普纳替尼 137.33 9.36 150 91.6% 14 阿西替尼 78.19 7.17 75 104.3% 15 N-去甲伊马替尼 3657.86 3.76 3750 97.5% 2.3最低浓度校准品色谱图 图2 15 种 TKIs药物色谱图(校准品1) 结论 本文建立了一种使用岛津液相色谱质谱联用仪内标法定量测定人血浆中15种酪氨酸酶抑制剂类抗肿瘤药物含量分析方法。利用蛋白沉淀的前处理方法，以内标法建立标准曲线，线性范围涵盖临床参考区间，分别考察了方法的线性、准确度和精密度性能，验证结果优异，可满足临床日常检验需求。该方法分析速度快，灵敏度高，专属性强，前处理简单，可为相关从业人员提供参考。 岛津应用云 本文建立了一种使用岛津液相色谱质谱联用仪内标法定量测定人血浆中15种酪氨酸酶抑制剂类抗肿瘤药物含量分析方法。利用蛋白沉淀的前处理方法，以内标法建立标准曲线，线性范围涵盖临床参考区间，分别考察了方法的线性、准确度和精密度性能，验证结果优异，可满足临床日常检验需求。该方法分析速度快，灵敏度高，专属性强，前处理简单，可为相关从业人员提供参考。