饲料中维生素B1检测方案(液相色谱仪)

【仪电分析】预混合饲料中维生素Bi的测定高效液相色谱法 维生素Bi又名硫胺素或抗神经炎素，是最早发现的维生素之一，由吡啶环和噻唑环结合而成的一种B族维生素。动物缺乏维生素Bi，碳水化合物就不能进行正常代谢，丙酮酸和乳酸在体内积聚，造成对神经系统、血液循环、消化系统等的机能障碍。 本方法参考GB/T 14700-2018《饲料中维生素Bi的测定》，适用于复合预混料饲料、维生素预混合饲料中维生素B1的测定。 一、方法原理 维生素预混料用流动相提取，试液注入高效液相色谱柱，用紫外检测器在 242 nm 处测定，外标法计算维生素Bi的含量。 二、主要仪器及试剂 a. 高效液相色谱仪：L220，带紫外检测器； b. 超声波水浴； c. 自动进样器； d. 电子天平； e. 针式过滤器； f. 离心机。 三、实验方法 3.1色谱参考条件 色谱柱：： Welch C18， 200mmx4.6 mmx5um； 进样量：20pL； 流速：11.0 mL/min： 柱温：28℃； 波长：242 nm； 3.2流动相配制 称取庚烷磺酸钠1.1 g、50 mg EDTA于 1000 mL 容量瓶中，加入约1000mL水，同时加入25 mL冰乙酸、约10 mL三乙胺，超声使固体溶解， pH计调节溶液 pH为3.7，过0.45um滤膜过滤3-5次至泡沫明显减少，取800 mL 该溶液， 与200 mL 甲醇混合既得，超声脱气30 min 冷却至室温待用。 3.2维生素Bi标准工作液配制 维生素Bi标准贮备液：取维生素Bi标准品(纯度大于99%)0.01g(精确至0.0001g)，溶解于酸性20%乙醇溶液(pH=3.5-4.3)中并定容至100 mL， 盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存，可使用3个月。该溶液含 0.1 mg/mL 维生素 Bi. 维生素Bl标准工作液：准确吸取5mL 维生素Bl标准贮备液于 50 mL 棕色容量瓶中，用流动相定容至刻度，该标准工作液浓度为1000 ug/mL， 该溶液存于2℃~8℃冰箱可以使用48h。 用标准工作液梯度稀释至100 ug/mL、50 ug/mL、20 ug/mL、10 ug/mL、5 ug/mL。 3.3试样溶液的制备 维生素预混合饲料提取液：称取50mg EDTA于1000 mL容量瓶中，加入约1000 mL去离子水，同时加入25 mL 冰乙酸、约10mL三乙胺，超声使固体溶解，调节溶液 pH=3~4，过0.45 um 滤膜，取800 mL 该溶液， 与200 mL甲醇混合既得。 称取试样0.05g(精确到0.0001g)， 置于25 mL棕色容量瓶中，加入提取液约40 mL，边加边摇匀，置于超声水浴中超声提取 15 min， 期间摇动2次，冷却，用提取液定容至刻度，摇匀。取少量溶液于离心机上4000 r/min 离心10 min， 上清液过 0.45 um 微孔滤膜，上HPLC测定。 测定：取相同体积试样制备液和标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，峰面积外标法定量。 四、实验结果 4.1标准工作曲线 维生素Bi工作曲线见图1： 维生素B，标准曲线 峰面积 图1标准工作曲线 4.2标准工作液色谱图 标准工作液色谱图见图2： 图2标准工作液色谱图 4.3预混料实际样品色谱图 实际样品色谱图见图3： [mV 图3实际样品色谱图 4.4计算 y=1509141.25×0.00003-1.0258=44.25 pg/mL 0.05g样品中含维生素 Bi： 44.25×25=1106.25 ug=1.10625 mg 1kg 样品中含维生素Bi： 1.10625×20=22.125 mg/g=22.125 g/kg 【仪电分析】预混合饲料中维生素B1的测定高效液相色谱法维生素B1又名硫胺素或抗神经炎素，是最早发现的维生素之一，由吡啶环和噻唑环结合而成的一种B族维生素。动物缺乏维生素B1，碳水化合物就不能进行正常代谢，丙酮酸和乳酸在体内积聚，造成对神经系统、血液循环、消化系统等的机能障碍。本方法参考GB/T 14700-2018《饲料中维生素B1的测定》，适用于复合预混料饲料、维生素预混合饲料中维生素B1的测定。一、方法原理 维生素预混料用流动相提取，试液注入高效液相色谱柱，用紫外检测器在242 nm处测定，外标法计算维生素B1的含量。二、主要仪器及试剂a. 高效液相色谱仪：L220，带紫外检测器； b.    超声波水浴；c. 自动进样器；d. 电子天平；e. 针式过滤器；f. 离心机。三、实验方法3.1 色谱参考条件色谱柱：Welch C18， 200mm×4.6 mm×5μm；进样量：20 μL；流速：1.0 mL/min；柱温：28 ℃；波长：242 nm；3.2 流动相配制 称取庚烷磺酸钠1.1 g、50 mg EDTA于1000 mL容量瓶中，加入约1000 mL水，同时加入25 mL冰乙酸、约10 mL三乙胺，超声使固体溶解，pH计调节溶液pH为3.7，过0.45μm滤膜过滤3-5次至泡沫明显减少，取800 mL该溶液，与200 mL甲醇混合既得，超声脱气30 min冷却至室温待用。3.2 维生素B1标准工作液配制维生素B1标准贮备液：取维生素B1标准品（纯度大于99%）0.01g（精确至0.0001g），溶解于酸性20%乙醇溶液（pH=3.5-4.3）中并定容至100mL，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存，可使用3个月。该溶液含0.1mg/mL维生素B1。维生素B1标准工作液：准确吸取5 mL维生素B1标准贮备液于50 mL棕色容量瓶中，用流动相定容至刻度，该标准工作液浓度为1000μg/mL，该溶液存于2 ℃~8 ℃冰箱可以使用48h。用标准工作液梯度稀释至100 μg/mL、50 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL。3.3 试样溶液的制备维生素预混合饲料提取液：称取50 mg EDTA于1000 mL容量瓶中，加入约1000 mL去离子水，同时加入25 mL冰乙酸、约10mL三乙胺，超声使固体溶解，调节溶液pH=3~4，过0.45 μm 滤膜，取800 mL该溶液，与200 mL甲醇混合既得。称取试样0.05 g（精确到0.0001g），置于25mL棕色容量瓶中，加入提取液约40 mL，边加边摇匀，置于超声水浴中超声提取15min，期间摇动2次，冷却，用提取液定容至刻度，摇匀。取少量溶液于离心机上4000r/min离心10 min，上清液过0.45μm微孔滤膜，上HPLC测定。测定：取相同体积试样制备液和标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，峰面积外标法定量。四、实验结果4.1 标准工作曲线维生素B1工作曲线见图1： 图1 标准工作曲线4.2 标准工作液色谱图标准工作液色谱图见图2： 图2 标准工作液色谱图4.3 预混料实际样品色谱图实际样品色谱图见图3： 图3 实际样品色谱图4.4 计算y=1509141.25×0.00003-1.0258=44.25μg/mL0.05g样品中含维生素B1：44.25×25=1106.25μg=1.10625 mg1kg样品中含维生素B1：1.10625×20=22.125 mg/g=22.125 g/kg