饲料中氨基酸含量检测方案(液相色谱仪)

【仪电分析】饲料中氨基酸含量的测定-高效液相色谱法 在饲料中添动氨基酸已经被广泛采用，-一般在谷物和豆粕为主的植物性饲料中赖氨酸、蛋氨酸等含量较低，不能满足动物的需要，添加氨基酸可以大大节省蛋白质用量，降低饲养成本，提高动物的生产效率。仪电分析参照《GB/T 18246-2019饲料中氨基酸的测定》，采用配备紫外检测器的 LC220 高效液相色谱仪，以L-赖氨酸和L-蛋氨酸为例，对饲料等样品中十几种氨基酸的测定方法做一简要介绍。 一、方法原理 对氨基酸进行柱前衍生后，在254nm 波长下，以保留时间定性，采用外标法分析时，需做标准曲线，无需加入正亮氨酸内标物。 二、主要仪器和试剂 a. LC220高效液相色谱仪，含紫外检测器； b.AS2000 液相自动进样器； c.蒸发回流装置； d.万分之一天平； e.恒温水浴锅； f.L-赖氨酸标准品； g.L-蛋氨酸标准品； h.甲醇、乙腈、正己烷：色谱纯； i.醋酸钠、乙酸、盐酸、苯酚分析纯； i.实验室常用玻璃仪器。 三、实验方法 3.1参考色谱条件及梯度洗脱程序 色谱柱 氨基酸专用柱(250mm*4.6mm5um) 流速 1.0mL/min 波长 254nm 柱温 35℃ 进样量 5uL 流动相 流动相A：甲醇：乙腈：水=20：60：20 流动相 B：50mmol/L 醋酸钠水溶液 梯度洗脱程序 时间/min 0~39 39~40 40~45 45~46 46~60 流动相A% 5→49 49→100 100 100→5 5 流动相B% 95→51 51→0 0 0→95 95 3.2试剂配制 3.2.1样品前处理溶液的配制 6mol/L的盐酸溶液：将盐酸溶液(36%-38%)与超纯水等体积混合，混匀； 0.1mol/L 的盐酸溶液：取8.3mL盐酸溶液(36%-38%)，用水定容到1000mL的容量瓶中，混匀； 0.1%苯酚的 6mol/L的盐酸溶液：移取20pL苯酚，加入 20mL6mol/L 盐酸溶液中，混匀。 3.2.2混合标准品溶液的配制 准确称量赖氨酸、蛋氨酸标准标准品配制成 2.5umol/mL 的赖氨酸、蛋氨酸标准溶液，用0.1mol/L 的盐酸溶液稀释成2.5、1.25、0.5、0.25、0.125umol/mL 系列浓度绘制标准曲线，4℃冷藏保存。 3.3衍生试剂的配制 三乙胺溶液：准确吸取 1.4mL 三乙胺至 10mL容量瓶中，用乙腈定容，摇匀，即得； 异硫氰酸苯酯溶液：准确移取250pL异硫氰酸苯酯至10mL容量瓶中，用乙腈定容，摇匀，即得。 3.4样品处理 3.4.1前处理 准确角取0.1000g样品于50mL圆底烧瓶中，加入10mL0.1%苯酚溶液溶解，110℃条件下加热回流 24h，反应完成后，冷却，转移到100mL容量瓶中，定容。量取 50mL溶液蒸干，用水定容至2mL， 待衍生。 3.4.2衍生反应 准确量取水解后溶液及氨基酸标准品 0.2mL， 分别置于 1.5mL离心管中(内标法需往每支离心管中准确加入正亮氨酸内标50uL)，然后分别加入三乙胺乙腈溶液 0.1mL 和异硫氰酸苯酯乙乙溶液 0.1mL，摇匀室温静置衍生1小时。衍生结束后分别加入 0.4mL 正己烷，密封后剧烈振荡 5~10s， 静置分层，取0.2mL下层溶液和0.8mL 水混合，过 0.45um有机系针式过滤器，待上机分析。 四、实验结果 4.1标样谱图 [mV] 4.2样品谱图 [mV] [min] 4.3标准曲线 L-蛋氨酸标准曲线 响应值 浓度 y=289746.8125x-8752.5， R=0.9996 L-赖氨酸标准曲线 响应值 y=478883.6875x-426.25， R=0.9998 4.4结果计算 备注： 本方法适用的氨基酸 Asp (L-天冬氨酸) Glu (L-谷氨酸) Ser(L-丝氨酸) Gly(甘氨酸) His (L-组氨酸) Arg (L-精氨酸) Thr (L-苏氨酸) Ala (L-丙氨酸) Pro (L-脯氨酸) NH4Cl(氯化铵) Tyr(L-酪氨酸) Val (L-缬氨酸) Met(L-蛋氨酸) Cys-Cys(L-胱氨酸) Ile (L-异亮氨酸) Leu(L-亮氨酸) Nle (L-正亮氨酸内标) Phe (L-苯丙氨酸) Trp(色氨酸) Lys (L-赖氨酸) 【仪电分析】饲料中氨基酸含量的测定-高效液相色谱法在饲料中添加氨基酸已经被广泛采用，一般在谷物和豆粕为主的植物性饲料中赖氨酸、蛋氨酸等含量较低，不能满足动物的需要，添加氨基酸可以大大节省蛋白质用量，降低饲养成本，提高动物的生产效率。仪电分析参照《GB/T 18246-2019 饲料中氨基酸的测定》，采用配备紫外检测器的LC220高效液相色谱仪，以L-赖氨酸和L-蛋氨酸为例，对饲料等样品中十几种氨基酸的测定方法做一简要介绍。一、方法原理对氨基酸进行柱前衍生后，在254nm波长下，以保留时间定性，采用外标法分析时，需做标准曲线，无需加入正亮氨酸内标物。二、主要仪器和试剂a.  LC220高效液相色谱仪，含紫外检测器；b.  AS2000液相自动进样器；c.  蒸发回流装置；d. 万分之一天平；e. 恒温水浴锅； f.  L-赖氨酸标准品；g. L-蛋氨酸标准品；h. 甲醇、乙腈、正己烷：色谱纯；i. 醋酸钠、乙酸、盐酸、苯酚分析纯；j. 实验室常用玻璃仪器。三、实验方法3.1 参考色谱条件及梯度洗脱程序梯度洗脱程序3.2 试剂配制3.2.1 样品前处理溶液的配制6mol/L的盐酸溶液：将盐酸溶液（36%-38%）与超纯水等体积混合，混匀；0.1mol/L的盐酸溶液：取8.3mL盐酸溶液（36%-38%），用水定容到1000mL的容量瓶中，混匀；0.1%苯酚的6mol/L的盐酸溶液：移取20μL苯酚，加入20mL6mol/L盐酸溶液中，混匀。3.2.2 混合标准品溶液的配制准确称量赖氨酸、蛋氨酸标准标准品配制成2.5μmol/mL的赖氨酸、蛋氨酸标准溶液，用0.1mol/L的盐酸溶液稀释成2.5、1.25、0.5、0.25、0.125μmol/mL系列浓度绘制标准曲线，4℃冷藏保存。3.3 衍生试剂的配制三乙胺溶液：准确吸取1.4mL三乙胺至10mL容量瓶中，用乙腈定容，摇匀，即得；异硫氰酸苯酯溶液：准确移取250μL异硫氰酸苯酯至10mL容量瓶中，用乙腈定容，摇匀，即得。3.4 样品处理3.4.1 前处理准确称取0.1000g样品于50mL圆底烧瓶中，加入10mL0.1%苯酚溶液溶解，110℃条件下加热回流24h，反应完成后，冷却，转移到100mL容量瓶中，定容。量取50mL溶液蒸干，用水定容至2mL，待衍生。 3.4.2 衍生反应准确量取水解后溶液及氨基酸标准品0.2mL，分别置于1.5mL离心管中（内标法需往每支离心管中准确加入正亮氨酸内标50μL），然后分别加入三乙胺乙腈溶液0.1mL和异硫氰酸苯酯乙腈溶液0.1mL，摇匀室温静置衍生1小时。衍生结束后分别加入0.4mL正己烷，密封后剧烈振荡5~10s，静置分层，取0.2mL下层溶液和0.8mL水混合，过0.45μm有机系针式过滤器，待上机分析。四、实验结果4.1 标样谱图4.2 样品谱图4.3 标准曲线L-蛋氨酸标准曲线y=289746.8125x-8752.5，R=0.9996 L-赖氨酸标准曲线y=478883.6875x-426.25，R=0.9998 4.4 结果计算 备注：