化妆品中雌酮、雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、睾丸酮、甲基睾丸酮、黄体酮、雌激素、雄激素、孕激素检测方案(液相色谱仪)

【仪电分析】化妆品中雌三醇等7种禁用组分的测定 化妆品不同于药品，作为日常消费品，安全性是最基本的要求。化妆品禁用组分一般是毒性或危害性较大的化学物质，添加了雌三醇等激素的化妆品，往往打着见效快的旗号误导消费者，长期使用不仅会严重损害害肤，对身体系统也损害巨大。本方案参照2015版《化妆品安全技术规范》中禁用组分检验方法2.4第二法：高效液相色谱-紫外检测器/荧光检测器法，该法适用于化妆品中雌三醇等7种组分含量的测定。 一、方法原理 样品提取后，经高效液相色谱仪分离，紫外检测器检测，以保留时间定性，峰面积定量。 二、仪器和试剂 2.1 LC220 高效液相色谱仪：配备紫外检测器； 2.2 AS2000 自动进样器； 2.3 C18柱：4.6 mmx250 mm， 粒径为5 u.m； 2.4分析天平：感量为0.0001g； 2.5离心机：转速>3000r/min； 2.6超声波发生器； 2.7 般实验室常用仪器。 2.8甲醇； 2.9饱和氯化钠溶液； 2.10环己烷； 2.11硫酸[(HzSO4)=2%]：取硫酸(p20=1.84g/mL)2mL，缓慢加入到98mL水中，混匀。 AS2000自动进样器 三、实验方法 3.1标准系列的制备 3.1.1激素标准溶液 (或直接购买混标) 雌激素标准溶液：分别称取称酮、雌二醇、雌三醇、己烯雌酚各0.2g(精确到0.0001g)，用少量甲醇溶解，转移至100mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度。 雄激素标准溶液：分别称取睾丸酮、甲基睾丸酮各0.6g(精确到0.0001g)，用少量甲醇溶解，转移至100mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，配制成含睾丸酮、、甲基睾丸酮为6.00mg/mL的溶液。取此溶液 10.0mL 置100mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度。 孕激素标准溶液：夜取黄体酮0.6g(精确到 0.0001g)，用少量甲醇溶解，转移至100mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，配制成含孕激素 6.00mg/mL 的溶液。取此溶液 10.0mL 置于100mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度。 混合标准储备溶液：分别取雌激素标准溶液50.00mL，雄激素标准溶液5.00mL 和孕激素标准溶液 5.00mL 置于 100mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，配制成1mL分别含4种雌激素各1.00mg、2种雄激素各30.0ug 和1种孕激素 30.0ug的混合标准储备溶液。 3.1.2混合标准系列溶液的制备 取混合标准储备溶液 0.00mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL于10mL具塞比色管中，用甲醇稀释至10mL刻度，制得混合标准系列溶液。 3.2样品处理 溶液状样品：称取样品1-2g(精确到0.001g)于10mL 具塞比色管中，在水浴上蒸除乙醇等挥发性有机溶剂，用甲醇稀释到10mL，作为样品待测溶液。 膏状、乳状样品：称取样品1-2g(精确到 0.001g)于100mL锥形瓶中，加入饱和氯化钠溶液 50mL，硫酸2mL，振荡溶解，转移至100mL分液漏斗中，以环己烷 30mL分三次萃取，必要时离心分离。合并环己烷层层在水浴上蒸除。用甲醇溶解残留物，转移到10mL具塞比色管中，用甲醇稀释到刻度。混匀后，经0.45um 滤膜过滤，滤液作为样品待测溶液。 3.3色谱条件 色谱柱 C18(250mm*4.6mm5um)或性能相当者 流速 0.6mL/min 波长 254nm 或 230nm 柱温 45°C 进样量 5uL 流动相 甲醇+水=75+25(可根据各分分分离效果微调比例) 注：根据相关文献及实际测试效果，采用230nm测试，各组分响应更高。 四、实验结果 4.1标样谱图 [mV] 4.2标准曲线 雌三醇 雌二醇 己烯雌酚 添加 Y 1 0.000 0.036 2 100.000 602041.938 3 200.000 1130687.625 4 500.000 2824985.750 5 6 7 8 9 10 雌酮 睾丸酮 编号\标题 Y 1 0.000 0.021 2 3.000 44085.762 3 6.000 88759.328 4 15.000 228248.531 5 6 7 8 9 10 甲基睾丸酮 黄体酮 添加 Y 1 0.000 0.029 2 3.000 41912.445 3 6.000 91885.094 4 15.000 239383.234 5 6 7 8 9 10 4.3样品谱图 某爽肤水测试图谱 [mV] [min] 加标样品 [mV] 1- - ： 1- 叫 1- 样品加标后表明 5.2min 左右的杂峰非雌三醇，原样品中无雌三醇检出。 【仪电分析】化妆品中雌三醇等7种禁用组分的测定化妆品不同于药品，作为日常消费品，安全性是最基本的要求。化妆品禁用组分一般是毒性或危害性较大的化学物质，添加了雌三醇等激素的化妆品，往往打着见效快的旗号误导消费者，长期使用不仅会严重损害肌肤，对身体系统也损害巨大。本方案参照2015版《化妆品安全技术规范》中禁用组分检验方法2.4第二法：高效液相色谱-紫外检测器/荧光检测器法，该法适用于化妆品中雌三醇等7种组分含量的测定。一、方法原理样品提取后，经高效液相色谱仪分离，紫外检测器检测，以保留时间定性，峰面积定量。二、仪器和试剂2.1  LC220高效液相色谱仪：配备紫外检测器；2.2  AS2000自动进样器；2.3  C18柱：4.6 mm×250 mm，粒径为5 µm；2.4 分析天平：感量为0.0001g；2.5 离心机：转速>3000r/min；2.6 超声波发生器；2.7 一般实验室常用仪器。2.8 甲醇；2.9 饱和氯化钠溶液；2.10 环己烷；2.11 硫酸[j(H2SO4)＝2%]：取硫酸（r20＝1.84g/mL）2mL，缓慢加入到98mL水中，混匀。三、实验方法3.1 标准系列的制备 3.1.1 激素标准溶液 （或直接购买混标）雌激素标准溶液：分别称取雌酮、雌二醇、雌三醇、己烯雌酚各0.2g（精确到0.0001g），用少量甲醇溶解，转移至100mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度。 雄激素标准溶液：分别称取睾丸酮、甲基睾丸酮各0.6g（精确到0.0001g），用少量甲醇溶解，转移至100mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，配制成含睾丸酮、甲基睾丸酮为6.00mg/mL的溶液。取此溶液 10.0mL置100mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度。 孕激素标准溶液：称取黄体酮 0.6g（精确到 0.0001g），用少量甲醇溶解，转移至100mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，配制成含孕激素6.00mg/mL的溶液。取此溶液 10.0mL置于100mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度。 混合标准储备溶液：分别取雌激素标准溶液50.00mL，雄激素标准溶液5.00mL和孕激素标准溶液5.00mL置于100mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，配制成1mL分别含4种雌激素各1.00mg、2种雄激素各30.0μg和1种孕激素30.0μg的混合标准储备溶液。3.1.2 混合标准系列溶液的制备取混合标准储备溶液0.00mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL于10mL具塞比色管中，用甲醇稀释至10mL刻度，制得混合标准系列溶液。 3.2 样品处理溶液状样品：称取样品 1-2g（精确到0.001g）于10mL具塞比色管中，在水浴上蒸除乙醇等挥发性有机溶剂，用甲醇稀释到10mL，作为样品待测溶液。膏状、乳状样品：称取样品 1-2g（精确到 0.001g）于100mL锥形瓶中，加入饱和氯化钠溶液50mL，硫酸2mL，振荡溶解，转移至100mL分液漏斗中，以环己烷30mL分三次萃取，必要时离心分离。合并环己烷层并在水浴上蒸除。用甲醇溶解残留物，转移到 10mL具塞比色管中，用甲醇稀释到刻度。混匀后，经0.45μm滤膜过滤，滤液作为样品待测溶液。3.3 色谱条件色谱柱C18（250mm*4.6mm，5μm）流  速0.6mL/min波  长254nm或230nm柱  温45℃进样量5μL流动相甲醇+水=75+25（可根据各组分分离效果微调比例）注：根据相关文献及实际测试效果，采用230nm测试，各组分响应更高。四、实验结果4.1 标样谱图4.2 标准曲线雌三醇 雌二醇己烯雌酚 雌酮睾丸酮甲基睾丸酮黄体酮 4.3 样品谱图某爽肤水测试图谱 爽肤水加标测试图谱样品加标后表明5.2min左右的杂峰非雌三醇，原样品中无雌三醇检出。