人血清中甲状腺激素检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-761Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-603 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050CL定量分析人血清中的甲状腺激素 T3和T4含量 LCMSMS-603 摘要：本文建立了一种使用岛津临床质谱 LCMS-8050CL 测定人血清中三碘甲腺原氨酸(T3)和四碘甲腺原氨酸(T4)的定量分析方法。使用同位素内标、标准样品及基质加标样品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性范围T3： 0.26~5.06 ng/mL， T4：4~200 ng/mL，满足临床参考区间要求，标准曲线相关系数均大于0.9990，方法准确度及精密度均可满足临床日常检验需求。该方法分析速度快，灵敏度高，专属性强，前处理简单，可为相关从业人员提供参考。 甲状腺主要合成和分泌甲状腺素(T4)和三碘甲状腺原氨酸(((T3)两种激素，T3 的活性大约是T4的5倍，但含量较低，这两种激素的生理功能主要为促进糖、蛋白质、脂肪等营养物质代谢，调节生长发育过程；提高大多数组织的耗氧量，促进能量代谢，增加产热和提高基础代谢。甲状腺疾病类型多样，主要包括甲亢、甲减、甲状腺炎症、甲状腺肿和甲状腺肿瘤等。 甲状腺疾病在诊断、治疗过程中都需要定期进行甲状腺功能检测，其检测指标主要包括：血清总三碘甲状腺原氨酸 (TT3)、血清总甲状腺素 (TT4)、血清游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、血清游离甲状腺素(FT4)和促甲状腺激素(TSH)。其中血清 TT4和TT3是判断甲状腺功能最基本的筛选试验。血清 TT4 和 TT3浓 度增高主要见于甲状腺功能亢进，血清 TT4 和TT3浓度降低主要见于甲状腺功能低下。检测手段方面目前临床多用免疫学方法对人体中TT3和TT4进行定量，该方法的准确性和重复性较差，因此为了进一步提高检测结果的准确性和可靠性，岛津开发了 TT4 和 TT3 的LC-MS/MS 定量方法。 本文参考中国医师协会检验医师分会临床质谱检验医学专业委员会的《液相色谱串联质谱临床检测方法的开发与验证》，在岛津LCMS-8050CL 平台上建立了一种简单高效的液相色谱质谱法同时测定人血清中 TT4和 TT3的定量分析方法。血清样本经蛋白沉淀和引入同位素内标后，加水适当稀释后进样分析，内标法定量人血清中TT4 和TT3含量。供相关检测人员参考。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津临床质谱 LCMS-8050CL， 具体配置如下： 输液泵：LC-30ACL在线脱气机： DGU-20A5RCL自动进样器：SIL-30ACMpCL柱温箱： CTO-30AC CL系统控制器：CBM-20A CL工作站软件：LabSolutions Version 5.87 1.2分析条件 表1 梯度洗脱程序 液相色谱条件 时间(min) A (%) B(%) 色谱柱： Shim-pack Velox PFPP(50 mm ×2.1mm ×1.9 um)， 0.01 60 40 货号：227-32019-02 0.2 60 40 流动相：A相-0.1%甲酸水，B相-0.1%甲酸甲醇 1.4 5 95 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为40%，时间程序见表1 流速： 0.4mL/min 2.4 5 95 进样器温度：15℃ 2.5 60 40 柱温：45℃ 进样量：30uL 3.0 60 40 质谱条件： 驻留时间：47ms 离子化模式： ESI(+) 离子源温度：300℃加热气：空气10.0L/min DL管温度：150℃雾化气：氮气3.0 L/min 加热模块温度：400℃干燥气：氮气10.0 L/min 扫描模式：多反应监测(MRM)MRM 参数：见表2 2MRM参数 化合物 前体离子>产物离子 Q1Pre CE Q3 Pre T4 777.80>731.75 -38 -31 -38 T3-13C6 657.95>611.95 -34 -21 -30 T4-13C6 783.80>737.85 -22 -26 -40 T3 651.80>478.85 -32 -33 -23 1.3样品制备和前处理 1.3.1标准品 表3标准品信息 名称 CAS 品牌 MW 四碘甲腺原氨酸 51-48-9 LGC 776.87 四碘甲腺原氨酸-c， 720710-30-5 Cerilliant 782.83 三碘甲状腺原氨酸 6893-02-3 Sigma 650.97 三碘甲状腺原氨酸-c， 1213431-76-5 Cerilliant 656.93 1.3.2样本制备 (1)混标工作液：分别称取1mg T3和T4标准品于10mL容量瓶，用含1%甲酸的甲醇溶液定容得0.1mg/mL浓度储备液，之后取10 uL T3储备液和 400 uL T4 储备液于10mL容量瓶，用甲醇定容得含0.1 ug/mLT3和4 ug/mL T4 混标工作液； (2) 内标工作液：分别移取T3-13c。和T4-3c，标准品于试剂瓶中加入含0.1%甲酸的甲醇溶液得到内标工作液 (T3-13c。 为1.5 ng/mL，， T4-13cg为 50 ng/mL))； (2)校准品：将T3&T4 混标工作液加入到含1%BSA 的 1xPBS 溶液得到6个系列浓度的校准品； (3)质控品：将T3&T4混标工作液加入到混合人血清中得到3个系列浓度的质控控。 1.3.3样本前处理 (1)移取50uL校准品/质控品/待测血清样本于 1.5 mL离心管； (2)加入200pL内标工作液于2000 rpm 涡旋混合1 min； 10000 rpm 4℃ 离心 5min； ) 取 100 uL 上清于进样小瓶并加入200uL纯水混匀； ).上机后自动进样器以30 uL进样分析。 实验结果 2.1临床参考区间 表4 临床参考区间(免疫发光法) 检测指标 摩尔浓度 质量浓度 血清总T3 1.01~2.48 nmol/L 0.65~1.60 ng/mL 血清总 T4 69.97~152.52 nmol/L 54.6~118.97ng/mL 2.2线性关系 图1 T3STD-3色谱图 &T3标准曲线 图2 T4 STD-3色谱图&T4标准曲线 标准浓度校准品(T3为0.26、0.56、1.06、2.06和 5.06 ng/mL； T4 为4、20、40、80和200ng/mL) 按1.3.3中前处理条件进行分析测定，以浓度比为横坐标，面积比为纵坐标，内标法制作校准曲线得到的线性方程、相关系数及线性范围见表5。 表5 标准曲线参数 # 名称 线性方程 相关系数 线性范围 (ng/mL) 准确度(%) 1 T3 f(x=0.01900917*x-0.00003858938 r=0.9996 0.26-5.06 96.8~105.5 2 T4 f(x)=0.001653930*x+0.001723166 r=0.9990 4-200 93.8~107.8 2.3精密度&准确度实验 本实验分别对低、中、高三个浓度的 T3和T4正常人血清基质加标样羊(质控品)进行5次重复测定，精密度相对标准偏差范围分别在6.6%~13.0%(T3)和0.8%~5.6%(T4)之间，准确度度相对标准偏差范围分别在8.0%~14.2%o(T3)和-0.4%~-8.0%(T4)之间，满足临床检测要求，数据结果见附录表6和表7。 表6 T3精密度&准确度结果(n=5) Sample Mean(ng/mL) %RSD Target(ng/mL) %Dev LQC 0.74 13.0 0.69 8.0 MQC 1.15 7.8 1.02 12.4 HQC 4.47 6.6 3.91 14.2 表 7T4精密度 &准确度结果 (n=5) Sample Mean(ng/mL) %RSD Target(ng/mL) %Dev LQC 49.23 5.6 53.53 -8.0 MQC 67.40 3.3 70.97 -5.0 HQC 198.40 0.8 199.14 -0.4 2.4定量限色谱图 图30.26ng/mL T3 色谱图(1%BSA 基质) 图44ng/mLT4色谱图(1%BSA基质) 结论 使用岛津临床质谱 LCMS-8050CL建立了检测人血清中三碘甲腺原氨酸(T3)和四碘甲腺原氨酸(T4)的定量分析方法。方法线性范围T3：0.26~5.06ng/mL，T4：4~200 ng/mL， 涵盖临床参考区间，线性宽度高于免疫方法，标准曲线的相关系数均大于0.9990。对 T3和T4低、中、高不同浓度的质控品进行精密度和准确度实验，结果表明T3和T4精密度相对标准偏差均在±13.0%以内，准确度相对标示偏均在14.2%以内，满足临床检测要求。 岛津应用云 使用岛津临床质谱LCMS-8050CL建立了检测人血清中三碘甲腺原氨酸（T3）和四碘甲腺原氨酸（T4）的定量分析方法。方法线性范围T3：0.26~5.06 ng/mL，T4：4~200 ng/mL，涵盖临床参考区间，线性宽度高于免疫方法，标准曲线的相关系数均大于0.9990。对T3和T4低、中、高不同浓度的质控品进行精密度和准确度实验，结果表明T3和T4精密度相对标准偏差均在±13.0%以内，准确度相对标准偏均在14.2%以内，满足临床检测要求。