血浆中糖皮质激素检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-265Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-495 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. - Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel ：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050 CL 测定人血浆中17种糖皮质激素含量 LCMSMS-495 摘要：本文使用岛津临床超高效液相色谱仪 LC-30A CL 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL联用建立了人血浆中17种糖皮质激素同时测定的方法。使用内标、标准样品及基质加标样品进行了方法法线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性范围宽，标准曲线相关系数均大于0.994，方法准确度及精密度均可满足临床日常检验需求。该方法分析速度快，灵敏度高，专属性强，前处理简单，可为相关从业人员提供参考。 关键词： LCMS-8050CL 糖皮质激素激素 血浆 糖皮质激素(Glucocorticoid， GCs)是由肾上腺分泌的一类甾体激素，其对糖、脂肪和蛋白质等生物合成和代谢过程具有较强的调节作用，还具有抑制免疫应答、抗炎、抗毒、抗休克作用。人工合成糖皮质激素是常用的治疗药物之一，通过糖皮质激素受体介导发挥药效，同样具有抗炎、抗毒、抗肿瘤和免疫抑制作用。目前，临床上至少有200-300种疾病会应用糖皮质激素治疗，其不仅用于各种肾上腺皮质功能异常性疾病的替代治疗，而且也广泛地应用于治疗自身免疫性疾病、过敏性疾病、血液系统疾病、哮喘、器官移植、皮肤病、眼疾等。糖皮质激素广泛应用的同时，也相继出现了较多不合理应用的现象。如果不恰当或长期使用糖皮质激素会导致多种病源性疾病，并且会引发肾上腺功能减退症及库欣综合征等误诊。目前糖 实验部分 1.1仪器 系统控制器：CBM-20A CL脱气机： DGU-20A5RCL输液泵：LC-30AD CL×2自动进样器：SIL-30ACMPCL柱温箱： CTO-30ACL检测器： SPD-M30A CL质谱检测器： LCMS-8050 CL色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.98 皮质激素检测手段主要有免疫法、‘气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱质谱法(GC-MS)、液相色谱质谱法(LC-MS)。但免疫法、气相色谱法、高效液相色谱法、 气相色谱质谱法在激素检测上或多或少均存在一些缺点，如对激素代谢的结构类似物不能区别检测，存在交叉反应；动态线性范围较窄；前处理复杂；对含量相对较低的激素检测的灵敏度不够；不能同时检测多种激素。而高效液相色谱质谱法因其高特异性、高灵敏度、一次可检测多种化合物等特点，被广泛应用于糖皮质激素测定。 本实验使用岛津临床用液相色谱三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL， 建立了人血浆中17种糖皮质激素含量测定方法，该方法分析速度快，灵敏度高，专属性强，前处理简单，可为相关从业人员提供参考。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack Velox C188 (100mm×2.1mml.D.，1.8um) 流动相：A相-水；B相-乙腈 流速：0.45 mL/min 柱温：40℃ 进样量：10uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为25%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command 断裂伸长率% 5.00 泵 B.Conc 25 7.00 泵 B.Conc 35 8.00 泵 B.Conc 95 9.00 泵 B.Conc 95 9.10 泵 B.Conc 25 11.00 控制器 Stop 质谱条件： 分析仪器：LCMS-8050 CL DL温度：150℃ 离子源： ESI(+)雾化气流速：3.0 L/min加热气流速：12.0L/min 接口温度：400℃ 加热模块温度：450℃干燥气流速：8.0L/min扫描模式：多反应监测(MRM)MRM 参数：见表2 表2MRM 参数 名称 前体离子 产物离子 Q1 PreBias (V) CE(V) Q1 PreBias (V) 曲安西龙 395.1 357.2 -17 -15 -16 395.1 225.1 -20 -20 -23 泼尼松龙 361.1 343.2 -20 -11 361.1 147.1 泼尼松 359.2 341.2 359.2 147.2 甲基泼尼松龙 375.2 357.2 375.2 161.2 倍他米松 393.2 373.2 393.2 355.2 地塞米松 393.2 373.2 393.2 355.2 曲安奈德 435.2 415.2 435.2 339.2 曲安西龙双醋酸酯 479.1 441.1 479.1 321.2 泼泥松龙醋酸酯 403.2 385.2 403.2 307.2 氟米龙 377.2 279.3 -11 377.2 321.3 -21 -14 -22 泼尼松醋酸酯 401.1 295.2 -16 -16 -14 401.1 147.1 -21 -23 -15 甲基泼尼松 417.2 399.2 -16 -12 -18 龙醋酸酯 417.2 253.3 -17 -21 -26 布地奈德 431.2 413.2 -18 -12 -14 431.2 147.2 -23 -31 -15 布地奈德 419.2 279.2 -22 -18 -29 419.2 321.2 -13 -14 -15 曲安奈德醋酸酯 477.2 457.2 -11 -16 477.2 339.1 -15 -12 倍他米松双丙酸酯 505.2 411.2 -40 -12 -19 505.2 319.2 -16 -21 氟氢可的松 381.2 239.1 381.2 267.0 -21 氟米松(内标) 411.1 253.2 -23 -17 -17 氟轻松(内标) 453.1 121.2 -24 -31 -19 卤美他松(内标) 445.1 155.1 -11 -32 -15 哈西奈德(内标) 455.1 105.2 -19 -54 -19 安西奈德((内标) 503.2 339.1 -40 -18 -22 1.3标准品及样品制备 标准溶液制备：取17种糖皮质激素混标母液，用甲醇稀释成相应浓度混标液。内标溶液使用甲醇配置成内标工作液。取200 uL空白血浆，20 uL混标液，涡旋混匀10s，得基质标准溶液，混标基质标曲浓度L1~L7分别为 0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、100 ng/mL，加入20uL内标溶液，涡旋混匀10s， 加入1mL乙酸乙酯，涡旋混匀1 min， 13000 rpm离心5min， 取850 uL 上清液至1mL96孔板中，室温氮气吹干，向96孔板中加入100 uL40%乙腈，振荡混匀 5 min，上机测定。 样品溶液制备：取200 uL血浆样本，加入20 uL内标溶液，涡旋混匀10s，加入1mL乙酸乙酯，涡旋混匀1 min， 13000 rpm 离心5 min， 取850uL上清液至1mL96孔板中，室温氮气吹干，向96孔板中加入100 uL40%乙腈，振荡混匀 5 min，上机测定。 结果与结论 2.1 MRM 色谱图 Q375.20>357.25 (+) 1.35e6Q393.20>355.25(+) 图1 糖皮质激素标准品谱图 2.2线性测定结果 对标准品按1.2中的分析条件进行分析，内标法制作标准曲线。标准曲线结果见表3，17种糖皮质激素在标准曲线浓度范围内线性相关系数均大于0.994，准确度在85.6%~112.4%之间，满足测定需求。 表3标准曲线结果 编号 名称 线性方程 相关系数 准确度(%) 曲安西龙 Y=(0.0816708)X+(0.0013143) 0.998 91.1~108.0 2 泼尼松龙 Y=(0.202297)X+ (0.00212863) 0.998 88.1~107.6 3 泼尼松 Y=(0.293945)X+ (0.00393414) 0.998 90.4~110.4 4 甲基泼尼松龙 Y=(0.339069)X+(0.00399323) 0.999 94.9-110.2 5 倍他米松 Y=(0.0754136)X+(0.0013019) 0.999 94.2~110.4 6 地塞米松 Y=(0.0724102)X+(0.0130596) 0.999 95.6~108.1 7 曲安奈德 Y=(0.315300)X+(0.00748315) 0.994 86.7~111.7 8 曲安西龙双醋酸酯 Y=(0.180955)X+(0.0107927) 0.996 91.2~109.1 9 泼尼松龙醋酸酯 Y=(0.100233)X+(0.00292863) 0.997 90.5~108.9 10 氟米龙 Y=(0.156072)X+(-0.0005509) 0.997 93.0~109.3 11 泼尼松醋酸酯 Y=(0.19418)X+(9.9127e-005) 0.996 86.9~111.9 12 甲基泼尼松龙醋酸酯 Y=(0.0679925)X+(0.0079558) 0.994 92.3~111.8 13 布地奈德 Y=(0.0909746)X+(0.0014738) 0.996 85.6~110.4 14 氟米龙醋酸酯 Y=(0.549688)X+(0.0308288) 0.996 95.5~109.6 15 曲安奈德醋酸酯 Y=(0.373039)X+(0.0642917) 0.996 89.9~112.4 16 倍他米松双丙酸酯 Y=(0.202822)X+(0.00434718) 0.998 94.1~108.2 17 氟氢可的松 Y=(0.0601693)X+(0.0008994) 0.998 92.2~107.7 2.3精密度测定结果 取混合对照品溶液(浓度为1ng/mL)，连续进样6针，考察仪器精密度，具体测定浓度及峰面积精密度见表4，结果显示，17种激素在测定浓度下峰面积精密度在1.7%~4.2%之间， LCMS-8050 CL测定17种糖皮质激素精密度良好。 表4精密度实验结果： ((in=6，ng/mL) 名称 平均峰面积 RSD% 名称 平均峰面积 RSD% 曲安西龙 37，566 1.8 氟米龙 91478 4.2 泼尼松龙 246，633 2.4 泼尼松醋酸酯 173297 2.3 泼尼松 303，986 2.8 甲基泼尼松龙醋酸酯 186803 2.9 甲基泼尼松龙 231939 布地奈德 178925 3.5 倍他米松 73317 氟米龙醋酸酯 435556 3.6 地塞米松 74124 曲安奈德醋酸酯 97309 3.0 曲安奈德 183079 倍他米松双丙酸酯 57929 3.3 曲安西龙双醋酸酯 91747 氟氢可的松 42942 2.2 泼尼松龙醋酸酯 145041 2.4准确度测定结果 按1.3中的前处理方法对空白血浆添加低中高浓度标准品作为低中高浓度质控品(添加浓度分别为0.2ng/mL， 5 ng/mL， 50 ng/mL)， 按1.2中的分析条件对质控品进行分析，每个样品平行制备3份，质控品的准确度结果如表5所示，结果显示质控品测定准确度结果与理论值接近，低中高浓度质控品准确度分别在87.8%~113.1%、93.9%~114.2%、87.9%~112.5%之间，满足临床测定需求。样品平行制备3份进样分析，低中高浓度质控品测定结果 RSD分别在 1.4%~5.7%、 表5质控准确度考察结果(n=3) 名称 LQC MQC HQC 回收率(%) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) 曲安西龙 101.4 3.5 97.1 3.2 103.1 3.2 泼尼松龙 104.5 4.4 103.3 4.1 96.9 4.1 泼尼松 98.2 2.1 104.1 1.8 94.2 1.8 甲基泼尼松龙 95.8 4.2 101.0 3.9 97.9 3.9 倍他米松 98.2 1.9 100.1 1.6 97.8 1.6 地塞米松 96.2 3.1 101.0 2.8 97.6 2.8 曲安奈德 106.3 3.7 104.2 3.4 96.4 3.4 曲安西龙双醋酸酯 93.3 5.7 105.0 5.4 100.7 5.4 泼尼松龙醋酸酯 98.5 4.1 99.8 3.8 104.6 3.8 氟米龙 113.1 3.7 98.6 3.4 96.3 3.4 泼尼松醋酸酯 90.2 2.5 101.2 2.2 100.7 2.2 甲基泼尼松龙醋酸酯 96.4 2.9 93.9 2.6 97.6 2.6 布地奈德 93.0 1.4 100.1 1.1 112.5 1.1 氟米龙醋酸酯 96.9 2.1 95.1 1.8 109.2 1.8 曲安奈德醋酸酯 87.8 2.7 114.2 2.4 98.5 2.4 倍他米松双丙酸酯 96.5 2.4 105.6 2.1 87.9 2.1 氟氢可的松 107.7 2.3 102.8 2.0 96.7 2.0 结论 使用岛津临床用超高效液相色谱仪 LC-30A CL与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL联用建立了人血浆浆17种糖皮质激素同时测定的方法。使用内标、标准样品及基质加标样品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性范围宽，标准曲线相关系数均大于0.994，方法准确度及精密度均可满足临床日常检验需求。该方法可以为临床人血浆中外源性激素同时检测提供很好的借鉴和参考。 岛津应用云 使用岛津临床用超高效液相色谱仪LC-30A CL与三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL联用建立了人血浆中17种糖皮质激素同时测定的方法。使用内标、标准样品及基质加标样品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性范围宽，标准曲线相关系数均大于0.994，方法准确度及精密度均可满足临床日常检验需求。该方法可以为临床人血浆中外源性激素同时检测提供很好的借鉴和参考。