CLAM-2030与LCMS-8050联用系统测定血液中的乙基葡萄糖醛酸苷

本文建立了一种使用岛津在线自动前处理仪CLAM-2030和三重四极杆液质联用仪LCMS-8050测定血液中EtG的方法。此联用系统从吸取样品、沉淀剂，到样品混匀、过滤以及将处理完的样品输送到LCMS/MS自动进样器，全部仪器自动完成。不涉及手动前处理操作，减小了人为误差，提高分析的准确度。本实验中检出限小于0.05 μg/mL，基质校准曲线的线性范围为0.1~10 μg/mL，准确度在85.3%~106.3%之间，方法灵敏度和准确度高，适合血液中乙基葡萄糖醛酸苷的检测，可供公安司法领域检测人员参考。 SSL-CA23-104Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-761 CLAM-2030 与 LCMS-8050联用系统测定血 液中的乙基葡萄糖醛酸苷 LCMSMS-761 摘要：本文参考《GA/T 1633-2019法庭科学血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验气相色谱-质 谱和液相色 谱-质谱法》建立了一种使用岛津在线自动前处理仪 CLAM-2030 和 三 重四极杆液质联用仪 LCMS-8050 测定血 液中的乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)的检 测 方法。实验结果表明，该方法检出限 小 于0.05 ug/mL， 基质校准曲 线的线性范围为 0.1~10 ug/mL， 准确度在 85.3%~106.3%之间 。重复性保留时间和峰面积RSD%分别在0.07%~0.09%和1.99 %~2.65%之间。质控样品的平均 回 收率在101.3~117.4% 之间， RSD% 在1.77~4.31%之间 ，满足标准的相关要求，适合血液中乙基葡萄糖醛酸 苷 的液相色谱-质谱法检测。 关键词：乙基葡萄糖醛酸苷 CLAM-2030 血液 GA/T 1633-2019 技术特点 ： 必自动前处理仪 CLAM-2030 与 LCMS/MS在线联用，无需手动操作，前处理简单方便。 乙基葡萄糖醛酸苷 (Ethyl Glucuronide， EtG) 是乙 醇在人体内代谢的标志性代谢物。相较 于 乙醇，其在血 液中存在 时 间更久，通常情况下， EtG 在血液中 的 存在 时间约为12h， 血液中 EtG 检测结果是判定个体在12h 内是否饮酒的重要证据。此外，血液中 EtG 的测 定 ，对 判定乙醇来源、区分是否血液腐败产生乙醇有 着 重要的 意义。 EtG 的 检测方法有 LC-MS/MS 和 GC-MS/MS 等，GC-MS/MS检测时，需要对 EtG 进行衍 生 ，前处理较为 复 杂，而用 LC-MS/MS 检测 EtG 则不需要衍生。 岛津开发 的 CLAM-2030 与 LC-MS/MS 联用系统，，可 对全血、血浆、血清、尿液、唾液等生物样品自动进行 蛋白沉淀操作，然后将上清液自动传输至 LC-MS/MS 进 行定量检测。本文使用该联用系统，参考《GA/T 1633-2019 法庭科学血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验气 相色谱-质谱和液相色谱-质谱法》，建立了血液中 EtG 的 LC-MS/MS 分析方法。该方法前处理简单，灵敏 度 和 准确度高，适合血液中的 EtG 检测方法。 1.1仪器 本实验使用岛津在线自动前处理仪 CLAM-2030 和岛津质谱 LCMS -8050，具体配置如下： 系统控制器： CBM-20A 脱 气 机：：DGU-20A5R 输液 泵 LC-30AD×2自动进样器：：SIL-30AC 柱温 箱： CTO-20A 质 谱 仪：：LCMS -8050前处理模块：CLAM-2030色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.93 图11CLAM-2030+LCMS-8050 联用系统 1.2分析条件 液相色谱条件 色 谱 柱： Shim-pack Scepter C18-120 (100 mm x2.1 mml.D.， 1.9 um，岛津 (上海)实验器材有限公司，P/N：227-31012-05) 流 动 相 A-0.01%甲酸-水溶液；B-甲醇溶液 ：进样体积 luL 柱 温：40℃流 速 0.3 mL/min 洗针 液：甲醇/水=1：1 (v：v) 洗脱方式： 梯度洗脱，B相起始浓度为7%，时间程序如表1所示。 表 1 梯 度洗脱时 间 程序 时间 (min) 单元 处理命令 值 1.00 泵 B Conc 7 2.00 泵 B Conc 60 3.00 泵 B Conc 60 3.10 泵 B Conc 7 6.00 控制器 STOP 质谱条件 子化模式：ESI(-)加热模块温度：400°℃加热气流速：空气 10.0 L/min 接口温度：300℃雾化气流速：氮气3.0L/min DL 温 度：250°℃干燥气流速：氮气10.0L/min 接口 电压：-2kV 扫描模式：多反应监测(MRM)MRM 渗 参 数：见表2 表2 15种卡西 酮 类新精神活性物质和内标的 MRM 参数 序号 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE Q3 Pre Bias (V) 1 乙基葡萄糖醛酸苷 221.15 74.95* 17.0 22.0 27.0 85.00 13.0 27.0 24.0 *代表定 量 离子对。 1.3校准曲线溶液配制 取 EtG 对照品储备液(100 ug/mL)，用乙腈逐级稀释，分别得到0.5， 1， 2， 5， 10， 50和 100 ug/mL 的 标准工作溶液。分别取各浓度的标准工作溶液100 uL， 加入900uL空白血液得到浓度分别为 0.05，0.1，0.2，0.5， 1，5和 10 ug/mL基质校准曲线溶液。 1.4样品前处理 在 CLAM-2030 工作站界面优化自动前处理参数、蛋白 沉 淀剂使用量、震摇转速、震摇时间、抽滤时间等 。确定样品自动前处理程序具体操作为： (1)吸取20uL甲醇活化过滤管，准备上样； (2)吸取基质校准曲线溶液或血液样品 50 uL 上样； (3)吸取水50 uL稀释样品； (3)吸取样本提取剂250uL； (4)转速 3000 rpm 震摇90s进行提取； (5)使用-50~-60 kPa 的负压抽滤过滤管60s； (6)接收管转移至自动进样器，进样1uL(详见图2)。 图2 CLAM-2030 在 线自动前处理过程 结果与讨论 2.1检出限和定量限溶液 MRM 色谱图 按1.2中的分析条件进行 测 定，0.05pg/mL 的检出限溶液色谱图的 S/N 大于3，0.1 ug/mL定量限溶液色谱 图的 S/N 大于10，灵敏度良好，符合定量要求。检出限和定量限溶液的 MRM色谱图如下图3所示。 图 3 EtG 检出限和定量限溶液 MRM 色谱G (0.1ug/mL) 2.2校准曲线 按1.2中的分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法绘制校准曲线，所得校准曲线线 性范围为 0.1~10 ug/mL， 线性关系良好，相关系数大于0.999， 准确度在 85.3%~106.3%之 间，校准曲线如 下 图4所示。 图4 EtG 校准 曲线 2.3精密度实验 按1.2中的分析条件进行测 定 ，选择低中高三个浓度对照品溶液，分别连续进样测定4次，考 察 仪器的精密 度 ，保留时间和 峰 面积的相对标准偏差如表3所示， RSD%分别在0.07%~0.09%和1.99%~2.65%之间，实验 结果表明，该分析方法具有良好的精密度。 表3 保留时间和峰 面 积精密度结果 (n=4) 序号 浓度(ug/mL) 保留时间 (RSD%) 峰面积 (RSD%) 1 0.1 0.09 2.65 2 1 0.07 2.16 3 10 0.07 1.99 2.4回 收率 向 空 白血液中添加 EtG标准品溶液，配制成浓度为0.1，1和10 ug/mL的样品加标溶液，每个水 平 重复测定 3次，加标样品的准确度和精密度结果如表4所示，平均回收率在 101.3~117.4% 之间， RSD% 在 1.77~4.31%之间。 表47方法回 收 率结果(n =3) 序号 加标浓度度 (ug/mL) 回收率 (RSD%) 相对标准偏差 (RSD%) 1 0.1 105.0 4.31 2 1 117.4 1.43 3 10 101.3 1.77 ■结论 本文建立了 一 种使用岛津在线自动前处理仪 CLAM-2030 和三重四极杆液质联用仪 LCMS-8050 测 定 血液中EtG 的方法 。此联用系统从吸取样品、沉淀剂，到样品混匀、过滤以及将处理完的样品输送到 LCMS/MS 自动进样器，全部仪器自动完成。不涉及手动前处理操作，减小了人为误差，提高分析的准确 度 。本实验中检出限小 于 0.05 ug/mL，基质校准 曲 线的线性范围为 0.1~10 ug/mL， 准确度在 85.3%~106.3%之间，方法灵敏度和准确度高，适合血 液中乙基葡萄糖醛酸苷的检测，可供公安司法领域检测人员参考。 岛津应用云