血浆中利福平检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-267Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-496 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050 测定血浆中利福平浓度 LCMSMS-496 摘要：本文建立了一种使用岛津 LCMS-8050三重四极杆液质联用仪测定血浆中利福平的方法。实验采用该系统在 6.0 min 内完成利福平的检测，采用同位素内标法定量，定量下限0.1 ug/mL，线性范围为 0.1~10 ug/mL，相关系数0.9997。定量下限与低、中、高三水平质控浓度的批内、批间精密度 RSD 均小于10.26%，各浓度水平质控样品的准确度均符合生物样本分析要求，提取回收率、基质效应等结果均符合生物样品分析要求。该方法具有分析速度快、专属性强、灵敏度高的特点，可用于人体内利福平血药浓度的测定。 关键词：三重四极杆液质联用仪 血浆 利福平 利福平是抗结核治疗的一线用药，在临床上应用较长时间，但是其个体差异大，尤其是对于一些特殊的用药群体例如儿童，合适的用药剂量仍然存在问题，用量过大容易导致肝损伤等系列不良反应，剂量不足又容易诱发耐药。 本文采用岛岛超高效液相色谱仪 LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用，建立了血浆中利福平的检测方法，该方法分析速度快、选择性强、灵敏度高，可供相关检测人员参考。 实验部分 1.1仪器 本实验采用岛津 LCMS-8050超高效液相色谱三重四极杆质谱联用系统，具体配置为： 系统控制器： CBM-20A脱气机： DGU-20A5R输液泵：LC-30AD×2自动进样器： SIL-30AC柱温箱：CTO-20AC质谱仪： LCMS-8050 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.98 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18(100 mm L.×2.1mml.D.，2.0 um， 岛津(上海)实验器材有限公司，PN： 227-30001-04)) 流动相：A相-5mM甲酸铵溶液，B相-乙腈 流速：0.3mL/min 进样体积：2uL 柱温：40℃ 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20%，时间程序见表1。 表1 时间程序 Time(min) Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 20 2.50 Pumps Pump B Conc. 90 3.50 Pumps Pump B Conc. 90 3.51 Pumps Pump B Conc. 20 6.00 Controller Stop 质谱条件： 分析仪器：LCMS-8050 碰撞气：氩气 离子源：ESI(+) 脱溶剂管温度：250℃ 接口电压：4.0kV 加热模块温度：400℃ 雾化气：氮气3.0 L/min 接口温度：300℃ 干燥气：氮气10 L/min 扫描模式：MRM 加热气：空气10 L/min MRM参数：见表2 表2MRM 参数 化合物名称 前体离子 产物离子 1 Pre (V) CE Q3 Pre (V) 利福平 823.40 399.20 -30.0 -26.0 -26.0 利福平 -D3 826.40 402.20 -30.0 -26.0 -26.0 1.3标准品与质控样品的配制 分别精密称取两份利福平适量，用甲醇溶解配制两份 1.0 mg/mL福福平储备液。取其中一份储备液用甲醇逐级稀释成浓度为500、250、100、50、25、10、5 ug/mL的标准工作曲线；另一份储备液用甲醇分别稀释成浓度为375、50、7.5 ug/mL的质控溶液。分别取标准工作曲线中各浓度点 20 uL 加入 980 pL人空白血浆中，依次配制成标准曲线0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 ug/mL；分别取三个不同浓度质控溶液 20 uL加入980 uL人空白血浆中，依次配制成0.15、1、7.5 ug/mL 质控样品。 精密称取利福平-D3适量，用甲醇溶解配制为 1.0 mg/mL储备液。将配制好的利福平-D3储备液用甲醇稀释为 1.0 ug/mL内标溶液，待用。 1.4血浆样品前处理方法 取 10 uL血浆样品，加入90uL水，加入10 uL内标溶液，加入390uL乙腈，涡旋振荡1分钟，11200C转/分钟离心5分钟，取100uL上清液，加900uL水，涡旋混匀后进样分析，进样体积2uL。 结果与结论 2.1方法选择性 取空白血浆，制备空白血浆样品 (double blank)、只添加内标的空白样品(blank) 、0.1 ug/mL 血浆基质加标样品，按照1.4方法处理并测定， MRM 色谱图见图1。结果表明，空白血浆中的内源物质无干扰，同时同位素内标对目标化合物的通道没有影响，方法具有较强的选择性。 ISTD 826.40>402.20(+) 2.90e1 A B E F 图1.利福平与利福平-D3色谱图(A、B： double blank 样品；C、D： blank样品； E、F： 0.1ug/mL血浆基质加标样品) 2.2线性范围 按照1.3中的条件制备0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 ug/mL 的血浆加标样品，按1.4中的前处理条件处理样品，按照1.3中的仪器条件进行测定，同位素内标法进行定量。所得校准曲线如图2所示，线性方程及相关系数见表3，其中y值代表利福平峰面积与利福平-D3 峰面积的比值，x值代表血浆中利福平浓度。结果表明该方法利福平在 0.1~10 ug/mL的浓度范围内线性关系良好，方法定量下限为0.1 ug/mL. Area Ratio 图2.利福平校准曲线 表 33校准曲线参数(线性回归，权重为1/C) 编号 名称 线性方程 相关系数 准确度(%) 利福平 Y=(0.498350)X+(0.00402801) 0.10~10.00 97.3~105.8 0.9997 2.3方法精密度与准确度 取已配制好的0.15、1.00、7.50 ug/mL质控样品以及定量下限 0.10 ug/mL样品，按照1.4方法制备，每个浓度的人血浆样品在1天内制备6份平行样品分析，连续测定3天，每日随行标准曲线，用测得的质控样品中利福平浓度计算批内及批间精密度，结果见表4。结果显示，各浓度水平精密度、准确度均符合生物样本分析要求。 表47方法批内批间精密度和准确度结果 理论浓度(ug/mL) 批内精密度 RSD% 批间精密度 RSD% 准确度% 0.10 7.86 10.26 84.5~116.9 0.15 8.43 9.46 83.8~112.6 1.00 2.90 4.49 95.9~113.2 7.50 1.17 4.44 89.0~104.1 2.4方法回收率考察 考察三个浓度质控样品(每个浓度重复6次)的回收率，结果如表5所示，各浓度水平利福平的回收率均大于85%。 表5方法回收率结果 浓度水平 理论浓度(ug/mL) 平均回收率% LQC 0.15 91.2 MQC 1.00 89.9 HQC 7.50 87.9 2.5基质效应考察 基质效应考察三个浓度水平质控样品(每个浓度重复6次)，分别计算各浓度水平的基质效应及内标归一化基质效应，结果见表6，各浓度水平基质效应因子及内标归一化基质效应因子均在85%~115%之间。 表6 基质效应考察结果 浓度水平 理论浓度 (ug/mL) 基质效应因子 内标归一化基质效应因子 LQC 0.15 101.1% 98.3% MQC 1.00 95.9% 93.2% HQC 7.50 96.2%. 93.5% 内标基质效应因子 102.9% 结论 本文使用岛津LCMS-8050 三重四极杆液质联用仪建立了血浆中利福平的测定方法。该方法在6.0 min 内快速完成利福平的检测，采用同位素内标法定量，定量下限0.1 ug/mL，线性范围为 0.1~10 ug/mL， 相关系数为0.9997。定量下限与低中高三水平质控浓度的批内、批间精密度及准确度均满足检测需求，回收率及基质效应等结果均符合生物样品分析要求。该方法快速简单、选择性强、灵敏度高，可用于血浆中利福平的定量分析。 岛津应用云 利福平是抗结核治疗的一线用药，在临床上应用较长时间，但是其个体差异大，尤其是对于一些特殊的用药群体例如儿童，合适的用药剂量仍然存在问题，用量过大容易导致肝损伤等系列不良反应，剂量不足又容易诱发耐药。本文采用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用，建立了血浆中利福平的检测方法，该方法分析速度快、选择性强、灵敏度高，可供相关检测人员参考。