番茄中游离氨基酸检测方案(液质联用仪)

结论版权所有◎2021珀金埃尔默公司。保留所有权力。 PerkinElmer是珀金埃尔默公司的注册商标。所有其他商标属于相应所有者的财产。 应 用 文 章 Liquid Chromatography/ Mass Spectrometry 作者： Derek Mattern， Ph.D. PerkinElmer， Inc. Rodgau， Germany Nick Salvin Mark Upton， Ph.D. PerkinElmer， Inc. Seer Green， UK In Collaboration with SyngentaJealott's Hill， Uk 使用 QSight 220 LC/MS/MS 方法分析番茄匀浆中的游离氨基酸 介绍 新鲜产品的氨基酸特征谱可以指示其营养价值和风味特征，因此，世界各地的 许多育种项目都集中在这些性状上。研究新鲜农产品的游离氨基酸含量，了解它们对风味(鲜味为L-谷氨酸，甜味为L-甘氨酸、L-丙氨酸和脯氨酸)和人体健康的影响(已证明支链氨基酸能加速肌肉损伤和运动后疲劳的恢复)1。 在本应用文章中，详细介绍了一种用于分析新鲜农产品中游离氨基酸含量的简单LC/MS/MS 方法。该方法样品制备过程简单，游离氨基酸可以直接进样分析，无需进行衍生化。 实验部分 将 Syngenta 测定氨基酸含量的内部方法转移至珀金埃尔默 LX50 UHPLC 上，未进行任何修改。将最高浓度水平的标准溶液(L1，见表1)注入至珀金埃尔默 QSight@ 220， 用以优化 MS/MS 离子对的入口电压和碰撞能量。 所有仪器控制、数据采集和数据处理均采用 Simplicity TM3Q软件平台进行。制备了7点校准曲线，包含多种浓度下的所有氨基酸和固定含量的内标(见表1)。将番茄样品匀浆并离心，然后用 3kDa的过滤器过滤上清液。所得液体用去离子水稀释400倍，使样品的预期浓度在校准范围内。样品中还加标有与校准标准品相同水平的气化内标。 本研究中使用的试剂包括：乙腈、甲酸、氨基酸标准品、气化氨基酸标准品和使用 Triple Red 水纯化仪获得的水。 根据适当的气代内标对化合物进行定量。 LC、离子对信息和离子源参数如表2-4所示。 结果 使用分析物标准品和溶剂内标的校准曲线对番茄匀浆样品中的所有化合物进行定量分析。用我们的方法和 QSight 质谱检测器可以实现对不同氨基酸的良好色谱分离和灵敏度。表5显示，对于所有氨基酸，均具有低 LOQ和良好的线性相关系数(>0.98))。 表1.氨基酸标准品的最低和最高浓度水平 分析物 标准品最低浓度 (ug/mL) 标准品最高浓度 (ug/mL) 丙氨酸 0.1 15 2，3，3，3-d4-丙氨酸内标 1 1 4-氨基丁酸(GABA) 0.1 15 精氨酸 0.015 2 天门冬酰胺 0.015 2 天门冬氨酸 0.1 15 甜菜碱 0.005 1 柠檬酸 0.3 30 柠檬酸-2，2，4，4-d4内标 5 5 谷氨酸 0.1 15 DL-谷氨酸-2，3，3，4，4-d5内标 1 1 谷氨酰胺 0.3 30 组氨酸 0.005 1 异亮氨酸 0.005 1 亮氨酸 0.005 1 蛋氨酸 0.015 2 苯丙氨酸 0.015 2 DL-d5-苯丙氨酸内标 0.5 0.5 脯氨酸 0.005 1 焦谷氨酸 0.015 2 丝氨酸 0.015 2 苏氨酸 0.015 2 色氨酸 0.005 1 酪氨酸 0.005 1 缬氨酸 0.015 2 表2.LC方法参数 时间 流速 流动相 (A%)水+ 流动相 (B%)乙腈+2% (min) (mL/min) 0.2%甲酸 水+0.2%甲酸 0 0.25 100 0 2.5 0.25 100 0 7.5 0.4 90 10 10 0.4 0 100 12 0.4 0 100 12.1 0.4 100 0 16 0.25 100 0 表3.分析物及其离子对参数 分析物 碰撞能量 极性 母离子 m/z 子离子 m/z 丙氨酸 + 90 44 16 2，3，3，3-d4-丙氨酸内标 + 94 48 14 GABA + 104 45 20 精氨酸 + 175 70 26 天门冬酰胺 + 133 74 23 天门冬氨酸 + 134 74 21 甜菜碱 + 118 58 38 柠檬酸 - 191 87 25 柠檬酸-2，2，4，4-d4内标 一 195 89 25 谷氨酸 DL-谷氨酸2，3，3，4，4-d5 + 148 84 21 + + 153 147 87 84 16 26 组氨酸 + 156 110 19 异亮氨酸 + 132 69 23 亮氨酸 + 132 43 36 蛋氨酸 + 150 61 32 苯丙氨酸 + 166 103 43 DL-d5-苯丙氨酸内标 + 171 106 43 脯氨酸 + 116 70 17 焦谷氨酸 - 128 128 5 丝氨酸 + 106 60 21 苏氨酸 + 120 56 28 色氨酸 + 205 118 23 酪氨酸 + 182 91 46 缬氨酸 + 118 55 30 表4.ESI源参数 干燥气 60 雾化气 350 电喷雾电压 5500V(正) -4000V(负) 离子源温度 315°C HSID 温度 200°C 表5.不同氨基酸的 LOQ 和线性相关系数 分析物 保留时间(min) 线性相关系数 LOQ (ug/mL) 组氨酸 1.5 R²=0.998 0.005 丝氨酸 1.6 R2=0.997 0.015 天门冬酰胺 1.6 R2=0.999 0.015 天门冬氨酸 1.6 R2=0.999 0.1 精氨酸 1.6 R2=0.991 0.015 谷氨酰胺 1.7 R2=0.999 0.3 苏氨酸 1.7 R2=0.999 0.015 谷氨酸 1.8 R2=0.999 0.1 甜菜碱 1.9 R2=0.997 0.005 GABA 1.8 R2=0.999 0.1 丙氨酸 1.7 R2=0.999 0.1 脯氨酸 2.1 R2=0.996 0.005 缬氨酸 3.0 R2=0.994 0.015 蛋氨酸 3.7 R2=0.991 0.015 柠檬酸 5.0 R2=0.999 0.3 焦谷氨酸 5.2 R²=0.993 0.015 异亮氨酸 6.1 R2=0.9997 0.005 亮氨酸 6.4 R2=0.999 0.01 酪氨酸 6.9 R2=0.999 0.005 苯丙氨酸 8.3 R²=0.999 0.015 色氨酸 9.3 R²=0.999 0.005 图1显示使用 D5-谷氨酸作为内标的天门冬酰胺的代表性校准曲线(上图)以及使用D5-谷氨酸作为内标的丝氨酸的代表性校准曲线(下图)，其中一种氨基酸在每个校准水平使用两次重复进样具有极好的线性。 图1.天门冬酰胺(上图)和丝氨酸(下图)的校准曲线都显示出极好的线性， R?>0.99。 图2显示来自两个校准水平(中等浓度和最低浓度)和番茄样品的天门冬酰胺和丝氨酸代表性色谱图重叠图。 图2.左图显示了天门冬酰胺色谱图的叠加图：蓝色为校准品水平 4(0.3 ug/mL)、绿色为色准品水平7 (0.015 ug/mL)、红色为番茄样品。右图显示了丝氨酸色谱图的叠加图：红色为校准品水平 4 (0.3 ug/mL)、蓝色为校准品水平7(0.015 ug/mL)、绿色为番茄样品。 将 Syngenta 内部方法转移至珀金埃尔默 QSight 220 上，未进行任何修改，可成功用于分析番茄匀浆中未进行衍生化的游离氨基酸。所有化合物检测均具有良好选择性和灵敏度。该方法可用于测定番茄匀浆中未进行衍生化的氨基酸含量。结果显示，样品中所有氨基酸在预期浓度范围内均呈良好线性。 ( 引用 ) ( 1. Ito H， Ueno H， Kikuzaki H (2017) Free Amino Acid Compositions for Fruits.J Nutr Diet Pract 1：001-005. ) 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司地址：上海张江高科技园区张衡路1670号邮编：201203电话：021-60645888传真：021-60645999www.perkinelmer.com.cn 欲获悉全球办事处的完整清单，请登录 www.perkinelmer.com/ContactUs 在本应用文章中，详细介绍了一种用于分析新鲜农产品中游离氨基酸含量的简单LC/MS/MS方法。该方法样品制备过程简单，游离氨基酸可以直接进样分析，无需进行衍生化。