人血浆中Favipiravir一种RNA聚合酶抑制剂检测方案(液质联用仪)

Application No.C230News岛津SHIMADZUhttp：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行行：2020年8月400-650-0439 ApplicationNews 使用带全自动预处理装置的LC/MS/MS系统进行人血浆中 Favipiravir 的测定 前言 Favipiravir (商品名： Favipiravir)是由富士胶片富山化学株式会社开发的一种 RNA 聚合酶抑制剂，被作为抗流感药物。C229 应用报告中介绍了通过使用人工预处理方法的 LC/MS/MS完成稳定、高灵敏度测定的案例。然而，采用人工预处理方法进行血浆样本的预处理会产生一定的作业负荷。本文为您介绍使用带全自动预处理装置的 LC/MS/MS 系统分析人血浆中 Favipiravir的方法，该方法可以避免人工操作造成的偏差和样本拿取错误，减少样本的暴露风险(图1)。 E. Imoto， D. Kawakami 图1带全自动预处理装置的LC/MS/MS 系统 (CLAMTM+LC/MS/MS) I血浆中 Favipiravir 的全自动预处理 在通过 LCMSTM分析血浆中的低分子量化合物时，通常使用有机溶剂进行蛋白沉淀处理，然后收集上清液并将其用于分析。在带全自动预处理装置的LC/MS/MS 系统中，直接将分离了血浆的采血管放置在系统中，就可以全自动进行上述预处理(图2)。LC/MS/MS 分析的同时进行下一样品的前处理，因此可大幅缩短分析单个样品所需的时间。 从血浆的预处理到通过LC/MS/MS 测定 Favipiravir 的过程，每个样品的分析时间为6.5分钟。 图2全自动预处理的工作流程 分析条件及样品的预处理 测定目标化合物 Favipiravir (PN： C8720*1)、及其稳定同位素标准品[c，15N]-Favipiravir (PN： C8853*1) 均从岛津制作所集团下属企业 Alsachim 公司购买， [c，1N]-Favipiravir 作为内标物质使用。在市售的经过 EDTA 2K处理的人血浆中添加Favipiravir，配制了标准曲线和QC样品。使用表1所示的 LC 及MS 的分析条件、表2所示的MRM 参数进行了测定。分析色谱柱使用了 Shim-pack ScepterTM C18-120(50 mm×2.1 mm I.D.， 1.9um、P/N：227-31012-03)。图3所示为各化合物的MS 色谱图及结构式。 各空白血浆中 Favipiravir 浓度为1、2、5、10、20、50、100 ug/mL， 作为校准点，分别以n=5绘制标准曲线。使用乙腈制备[c，1N]-Favipiravir (20 ug/mL) 的溶液，作为 ISTD 使用。图2显示了 Favipiravir 的血浆样品的预处理方法。向50 uL的血浆内添加20 uL 的75 %IPA 水溶液、10 uL 的 ISTD、200uL乙腈，混匀，之后使用 PTFE 膜过滤器过滤等过程全部为自动处理，处理后的样品直接用于 LC/MS/MS 分析。 *1岛津 GLC 及 Alsachim 产品编号 表 1 LC 及 MS的分析条件 < LC 分析条件> UHPLC NexeraTM X2 LC/MS/MS 系统 LCMS-8060 分析柱 Shim-pack Scepter C18-120(50 mm x 2.1 mm l.D.， 接口 加热 ESI 1.9 pm) 流动相 A：0.05%甲酸-水B： 0.05%甲酸-乙青 MS检测模式 MRM(+) 梯度程序 (%B) 5%(0-0.30min) 30%(0.35 min) 90%(1.50-2.50 min) 5%(2.60-4.00 加热块温度 400°℃ min) 流速 0.4 mU/min DL温度 250°℃ 柱温箱温度 40°C 接口温度 300℃ 进样量 1.0 pL 雾化气流量 3 L/min 清洗溶液 MeOH 干燥气流量 10 L/min (仅进样针外 部清洗) 加热气流量 10 L/min 表2 Favipiravir 及[]C，15N]-Favipiravir 的 MRM 参数 化合物名称 离子 前体离子(m/z) 产物离子(m/z) Favipiravir 定量离子对 157.70 85.10 定性离子对 157.70 113.20 [13C15N]-Favipiravir 定量离子对 159.70 85.10 定性离子对 159.70 113.20 图 3 Favipiravir (左)、[]C，15N]-Favipiravir(右)的MS 色谱图及结构式 标准曲线的绘制 表3所示为使用带全自动预处理装置的LC/MS/MS 绘制标准曲线的结果。在所设定的定量范围取得了R=0.9987的良好线性。通过评估准确度(准确性)及精度(重复性)发现，在包含定量下限的全浓度范围中，精度为 %RSD 1.0%-5.6%。此外，准确度为95%-105%，在100±15%范围以内。 表3使用全自动 LC/MS/MS 分析血浆中 Favipiravir 时的线性、准确度及精密度 Favi piravir ID 加标浓度(pg/mL) 平均浓度(pg/mL) 精密度%RSD 精确度% 校准曲线 空白样品 --- --一 面积比 223=4271 099 20 1760209393799 =0.9987602 R0.9993799..标准曲线的种类：默认(直线)18权重：默认值(1/C)16原点通过默认值(不通过) 3Mean RF：4.186630e+DO014 SD RF： 14947940-0013%RSD：357040012 R2=0.9987 2530浓度比(ppml 1级 1 1.04 4.3 104 2级 2 2.00 1.9 100 3级 5 4.77 2.4 95 4级 10 9.87 1.9 99 5级 20 19.7 3.5 99 6级 50 52.7 1.0 105 7级 100 97.9 5.6 98 l评估使用QC样品的分析系统的适用性 表4血浆中 Favipiravir 分析的并行精度 将血浆中浓度分别制备为3、50、90 ug/mL 的试样作为 QC 样品，评估了并行精度(表4)及3天的日间重现性(表5)。并行精度的评估结果是， Favipiravir 的精度为 %RSD 1.6%-3.0%。此外，准确度为94%-97%，在100±15%范围以内。日间重现性的评估结果是， Favipiravir 的精度为 %RSD 0.2%-7.6%。此外，准确度为88%-99%，在3天各自的QC 样品测定中达成了100±15%。 化合物 QC样品 加标浓度(pg/mL) 批内分析(n=6) 平均浓度(ug/mL) 精密度RSD% 精确度 % 97 中 50 48.3 3.0 97 94 表5血浆中 Favipiravir 分析的日间重现性 化合物 QC样品 第1天(n=3)平均值 第2天(n=3)平均值 第3天(n=3)平均值 加标浓度(ug/mL) 平均浓度(ug/mL) 精密度RSD% 精确度% 平均浓度(ug/mL) 精密度RSD% 精确度% 平均浓度(ug/mL) 精密度RSD% 精确度% Favipiravir 低 3 2.95 0.2 98 2.94 7.6 98 2.64 3.7 中 50 49.3 1.0 99 47.1 2.8 94 46.0 3.6 92 高 90 85.8 1.3 95 81.3 1.0 90 79.4 1.7 88 结论 本文件中记载的产品尚未作为医疗器械得到医药品医疗器械法的批准和认证。无法用于治疗诊断目的，无法通过正常程序使用。 建立了带全自动预处理装置的 LC/MS/MS 分析系统进行血浆中Favipiravir 测定的方法。绘制标准曲线后发现，具有良好的线性。使用QC样品对重复性和日间重现性进行评估后，得到了良好的准确性和重现性。 CLAM、LCMS、Shim-pack Scepter 及 Nexera 是岛津制作所株式会社在日本及其他国家所使用的商标。 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 ( 如有变动，恕不另行通知。 ) Favipiravir（商品名：Favipiravir®）一种RNA聚合酶抑制剂，被作为抗流感药物。采用人工预处理方法进行血浆样本的预处理会产生一定的作业负荷。本文为您介绍使用带全自动预处理装置的LC/MS/MS系统分析人血浆中Favipiravir的方法，该方法可以避免人工操作造成的偏差和样本拿取错误，减少样本的暴露风险。建立了带全自动预处理装置的LC/MS/MS分析系统进行血浆中Favipiravir测定的方法。绘制标准曲线后发现，具有良好的线性。使用QC样品对重复性和日间重现性进行评估后，得到了良好的准确性和重现性。