人血浆中Favipiravir一种RNA聚合酶抑制剂检测方案(液质联用仪)

Application No.C229Newshttp：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行行：2020年8月400-650-0439 ApplicationNews 人血浆中 Favipiravir 的测定 前言 Favipiravir (商品名： Favipiravir)是由富士胶片富山化学株式会社开发的一种 RNA 聚合酶抑制剂，被作为抗流感药物。在本文中，本公司建立了使用具有出色的可选择性的分析方法LC/MS/MS(图1)，对添加在血浆中的 Favipiravir 进行分析的分析系统，在本文中介绍相关研究成果。 E. Imoto， D. Kawakami 图1 LCMSTM-8060 的外观图 |分析条件及样品的预处理 测定目标化合物 Favipiravir (PN： C8720*1)、及其稳定同位素[c，15N]-Favipiravir (PN： C8853*1)均从岛津制作所的集团下属企业 Alsachim 公司购买， [c，15N]-Favipiravir 作为内标物质使用。图2所示为 Favipiravir 及[c， 15N]-Favipiravir 的结构式。在市售的经过 EDTA 2K 处理的人血浆中添加 Favipiravir，绘制了标准曲线。使用表1所示的LC 及MS 的分析条件、表2所示的MRM 通道进行了测定。分析色谱柱使用了 Shim-pack ScepterTMC18-120 (50 mm×2.1 mm l.D.， 1.9 um、P/N： 227-31012-03)。MS色谱图如图3所示。 各样品将 Favipiravir 制备为血浆中1、2、5、10、20、50、100 ug/mL，作为校准点，分别以n=5绘制标准曲线。使用乙腈制备[3c，15N]-Favipiravir (20 ug/mL) 的溶液， 作为 ISTD使用。 图4所示为预处理方法的流程。添加75%IPA 20 uL、血浆50 uL、ISTD 10 uL、乙腈200uL，进行充分搅拌后，将离心分离得到的上清液移至 LC试剂瓶中，进行检测。 *1岛津 GLC 及 Alsachim 产品编号 Favipiravir [13C，15N]-Favipiravir 图2 Favipiravir 及[]C，15N]-Favipiravir 的结构式 表1 LC 及MS的分析条件 UHPLC NexeraTMX2 LC/MS/MS系统 LCMS-8060 分析柱 Shim-pack Scepter C18-120(50mm×2.1 mmI.D.， 接口 加热 ESI 1.9 pm) 流动相 A：0.05%甲酸-水 B： 0.05%甲酸-乙青 MS检测模式 MRM (+) 梯度 5%(0-0.30 min) 加热块温度 400°℃ 程序(%B) 30%(0.35 min) 90 DL温度 250℃ %(1.50-2.50min) 5%(2.60-4.00 min) 流速 0.4 mL/min 接口温度 300℃ 柱温箱温度 40°℃ 雾化器气体流量 3L/min 进样量 1.0 pL 干燥气体流量 10L/min 清洗溶液 MeOH 加热气体流量 10 L/min (仅外部清洗) 表 2 Favipiravir 及[13C，15N]-Favipiravir 的 MRM 通道 化合物名称 离子 前体离子(m/z) 产物离子(m/z) Favipiravir 定量离子 157.70 85.10 定性离子 157.70 113.20 [C15N]-Favipiravir 定量离子 159.70 85.10 定性离子 159.70 113.20 及[C，15N]-Favipiravir (右)的MS色谱图 *[C，15N]-Favipiravir：乙腈中国浓雾为 20pg/mL 图4血浆中 Favipiravir 的预处理流程 表3所示为向血浆添加标准样品绘制的标准曲线的结果。在所设定浓度范围取得了R=0.9998 的良好线性。通过过估准确度(准确性)和精度(重复性)的结果，精度为 %RSD 1.7 %-6.5%。此外，准确性为96%-103%和100±15%以内。 表3分析血浆中 Favipiravir 时的线性、准确度和精度 Favi piravir ID 加标浓度(pg/mL) 平均浓度(pg/mL) 精密度%RSD 精确度% 校准曲线 空白样品 --- 面积比 Favipiravir25.0=y=5.089523x+0.0221756298239Rm09999121 22.5 20.011 标准中类：默认(直线)：权重： 直(1/C)原点通过默认值(不通过) 17.5-Mean RF： 5.208638e+000SDRF： 1.091149e-00115.0%R5D：2.094884 12.510.07.5 R2=0.9998 5 0.010.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.54.0 4.55.0 浓度比(pg/mL) 1级 1 0.96 2.3 96 2级 2 2.00 6.5 100 3级 5 4.98 2.3 100 4级 10 10.3 1.9 103 5级 20 20.5 1.7 103 6级 50 49.8 1.9 100 7级 100 99.5 1.9 100 评估使用QC样品的分析系统的适用性 表4血浆中 Favipiravir 分析的精密度 将血浆中浓度分别制备为3、50、90 pg/mL的试样作为QC样品，评估了精密度(表4)及3天的日间重现性(表5)。精密度的评估结果是， Favipiravir 的精度为%RSD 1.7 %-4.5%。此外，准确性为98%-104%和100±15%以内。日间重现性的评估结果是，Favipiravir 的精度为%RSD 0.1 %-5.2%。此外，准确性为89%-102%，在3天各自的QC样品测定中达成了100±15%。 化合物 QC样品 批内分析(n=6) 加标浓度(ug/mL) 平均浓度(ug/mL) 精密度RSD% 精确度% 2.6 104 中 50 49.2 4.5 98 90 100 表5血浆中 Favipiravir 分析的日间重现性 化合物 QC样品 加标浓度(ug/mL) 第1天(n=3)平均值 第2天((n=3)平均值 第3天 (n=3)平均值 平均浓度(ug/mL) 精密度RSD% 精确度% 平均浓度(ug/mL) 精密度RSD% 精确度% 平均浓度(ug/mL) 精密度RSD% 精确度% Favipiravir 低 3 3.05 0.1 102 2.89 4.6 96 2.67 5.2 89 中 50 49.0 1.1 98 47.5 1.0 95 46.4 2.2 93 高 90 90.2 0.4 100 88.3 4.2 98 87.6 2.4 97 分析系统的稳定性试验 为了评估本次建立的分析系统的稳定性及重现性，使用将血浆中浓度制备为 10 ug/mL的试样，连续测定了100次。每次进样得到的面积值用第一次进样得到的面积值归一化和统计的结果如图5所示。连续测定100次的结果发现， Favipiravir 的 %RSD 为 2.9%，[c，15N]-Favipiravir 的 %RSD 为 3.2%，具有较高的注入重现性。上述结果表明，本分析系统可以长时间维持高灵敏度分析，具有良好的稳定性。 结论 建立了血浆中 Favipiravir 测定的 LC/MS/MS 的分析系统。绘制标准曲线后发现，可以得到良好的线性。另外，为评估分析系统的稳定性而进行连续100次测定，结果显示可长时间维持高灵敏度的分析，具有良好的稳定性。 ( 本文件中记载的产品尚未作为医疗器械得到医药品医疗器械械的批准和认证。 ) 图 5 Favipiravir、及[C，15N]-Favipiravir 的连续100次测定结果用第一次进样得到的面积值归一化，统计各进样结果 ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 ) ( 如有变动，恕不另行通知。 ) Favipiravir（商品名：Favipiravir®）是由富士胶片 富山化学株式会社开发的一种RNA聚合酶抑制剂，被作为抗流感药物。在本文中，本公司建立了使用具有出色的可选择性的LC-MS/MS分析方法，建立了血浆中Favipiravir测定的LC/MS/MS的分析系统。绘制标准曲线后发现，可以得到良好的线性。另外，为评估分析系统的稳定性而进行连续100次测定，结果显示可长时间维持高灵敏度的分析，具有良好的稳定性。