人促血红细胞生成素中聚集体检测方案(液相色谱仪)

使用 AdvanceBio SEC 色谱柱分析人促血红细胞生成素的聚集体 作者 前言 米健秋 人促血红细胞生成素 (Erythropoietin， EPO) 是最早用于治疗贫血症的商业化糖蛋白之一。与其它生物治疗蛋白一样，聚集体监测是评价 EPO 的关键质量属性之一。在欧洲药典 (European Pharmacopoeia， EP) 10.0版中，详细规定了使用体积排阻色谱 (SizeExclusion Chromatography， SEC) 结合峰面积归一化法分析 EPO样品中的二聚体及其它大于主成分分子量的有关蛋白比例的方法。 相比之前的EP 版本，10.0版对 EPO 的体积排阻色谱方法所作的主要修订在于使用粒径较小且柱长较短的色谱柱。这样在保证分离度的前提下，大幅度缩短了分析所用的时间。Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱采用新一代填料修饰工艺，能够更有效抑制 SEC 分析中可能存在的非特异性相互作用。其填料粒径为2.7 pm， 工作压力适中，同时可提供更高的塔板数与分离度。 本研究使用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱并结合 EP方法流动相和色谱条件，对EPO样品进行体本排阻分析。结果完全满足欧洲药典 EP 10.0 版中有关系统适应性的要求，表明该方法适用于 EPO的生产过程质量控制以及其它相关的研究工作。 流动相溶液配制：称取1.91g十二水合磷酸氢二钠、0.2 g 磷酸二氢钾和23.4g氯化钠，共同溶于900 mL水中，并在必要时将 pH调节至7.4，用水定容至1000mL。 样品溶液配制：分离度考察溶液(resolution solution)配制，使用流动相稀释样品至0.2 mg/mL 并混匀；对照品溶液((reference solution) 配制，移取20 pL分离度考察样品，使用流动相稀释至1mL并混匀。 分析采用 Agilent 1260 四元泵液相色谱系统，配备可变波长检测器。所用的色谱条件如表1所示。 表1.液相色谱分析条件 表2.EP的系统适应性要求对比 色谱柱 AdvanceBio SEC， 7.8×300 mm，2.7 pm， 300 A， 部件号： PL1180-5301 流量 0.5 mL/min 柱温 室温 进样体积 100 pL 检测波长 214nm 运行时间 30 min 色谱柱 EP 系统适应性指标 本实验结果 对照样品主峰面积占分离度考察样品 1.5%-2.5% 1.8% 主峰面积百分比 分离度考察样品中二聚体峰与单体峰 >1.5 1.7 的分离度 分离度考察样品中主峰前的所有峰面 <2% 0.2% 积加和比例 表3.连续进样的重现性考察(n=3) 分离度考察溶液的分析结果如图1所示，表明单体与二聚体峰得到了良好的分离。另外，参照EP的系统适应性要求对实验结果进行分析，结果列于表2中。从表2可以看出，本实验结果完全符合EP的系统适应性要求。此外，本文还对方法重现性进行了讨论。如表3所示，列出了连续进样三针所得到的重现性数据，表明该方法的保留时间以及峰面积百分比具有出色的重现性。 1 2 3 RSD 主峰保留时间 15.06 15.07 15.07 0.04% 主峰峰面积 15183 15165 15165 0.07% 聚集体百分比 0.222 0.216 0.208 3.26% 5 10 15 20 25 min 图1.分离度考察溶液的 SEC 分析结果 ( Ⅰ.( C owper， B.， X . Li，L. Y u， Y . Zhou， W. H. Fan， and C. M. Rao. 2018. Comprehensive g l ycan analysis of twelve recombinanthuman erythropoietin preparations from manufacturers inChina a nd Japan. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 153：214-20. doi：10.1016/j.jpb a .2018.02.043 ) 2..tEuropean Pharmacopoeia version 10.0， Monograph"Erythropoietin concentrated solution" 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ) ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2020 人促血红细胞生成素 (Erythropoietin, EPO) 是最早用于治疗贫血症的商业化糖蛋白之一。与其它生物治疗蛋白一样，聚集体监测是评价 EPO 的关键质量属性之一。在欧洲药典 (European Pharmacopoeia, EP) 10.0版[2] 中，详细规定了使用体积排阻色谱 (Size Exclusion Chromatography, SEC) 结合峰面积归一化法分析 EPO 样品中的二聚体及其它大于主成分分子量的有关蛋白比例的方法。