酸奶中有机酸、糖类定量分析检测方案(液相色谱仪)

LAAN-A-LC254 ApplicationnNNo.L548News 用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行日：2019年8月400-650-0439 ApplicationNews 高效液相色谱法 NexeraTM 双进样系统监测发酵过程 No.L548 微生物分解各种物质并产出有用的物质，这个过程称为发酵。近年来，除了食品以外，发酵也被广泛运用于工业领域。为理清发酵过程并优化其条件，对有机酸、糖、氨基酸等多种化合物进行了测定，展开了多方面分析。使用 HPLC 法时，由于不同的化合物所适用的分离模式以及检测方法各不相同，因此需要分别单独分析。本文介绍了一种使用双进样系统监测发酵过程的分析方法，在同一个系统中同时执行两种类型化合物的分析。 K. Koterasawa 双进样系统的概要 利用 Nexera 的自动进样器 SIL-40系列的可定制双进样功能，对独立的两条流路分别进样，同时进行不同条件的两个系统的分析。另外，本系统获得的两个结果可以汇总到一个数据文件中，确保了样品数据的可追溯性。方法文件、批处理文件也汇总到一个文件中，因此可以便捷的进行分析操作。 图1所示为双进样系统流路图。第一条流路使用了离子排阻色谱柱、柱后缓冲电导法、电导检测器对有机酸进行分析；第二条流路使用配体交换色谱柱、示差折光检测器对糖类进行分析。由于有机酸和糖类分析时柱温条件不同，因此分别使用两台 CTO-40S柱温箱来控制温度。 图1双进样系统流路图 有机酸的分析 流路①对有机酸进行分析。图2所示为有机酸(柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、醋酸)的混合标准溶液(各100mg/L)的色谱图，表1为有机酸的分析条件。 图2有机酸混合标准溶液的色谱图 表1有机酸的分析条件 色谱柱 ：Shim-packTM Fast-OA (100 mm L.×7.8 mmI.D.， 5 pm)(使用2根) 保护柱 ：SShim-pack Fast-OA(G) (10 mm L.×4.0 mm l.D.， 12 um) 流动相流速 ： 0.8mL/min pH缓冲液流速 ： 0.8 mL/min 流动相 ：5.0 mmol/L p-甲苯磺酸水溶液 pH缓冲液 ：5.0mmol/L p-甲苯磺” 20 mmol/L Bis-Tris. 0.1 mmol/L EDTA 混合水溶液 柱温 ：40℃ 进样量 ： 10uL 检测器 ：电导检测器 有关使用 Shim-pack Fast-OA与柱后缓冲电导法的分析详情，请参考技术报告《使用 Shim-packFast-OA与 pH缓冲电导检测法对有机酸快速分析(C190-0489)》。 流路②对糖类进行分析。图3所示为糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖)的混合标准溶液(各1000 mg/L) 的色谱图，表2为糖类的分析条件。 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min 图3糖混合标准溶液的色谱图 表2糖类的分析条件 色谱柱 ： Shim-pack SCR-101C (300 mm L.X7.9 mmI.D.， 10 pm) 保护柱 ： Shim-pack 保护柱 SCR(C) (50 mmL.×4 mmI.D.， 10 um) 流速 ：1.0 mL/min 流动相 ：水 柱温 ：80℃ 进样量 ：10uL 检测器 ：示差折光检测器 |重复性 表3、表4分别显示了有机酸混合混准溶液(各200mg/L)以及糖混合溶液标准溶液(各1000 mg/L) 连续6次分析的保留时间和峰面积RSD%结果。所有成分的保留时间、峰面积RSD%相对标准偏差结果均小于1%。 表3有机酸标准溶液分析结果(n=6) 化合物名称 保留时间 保留时间 峰面积 平均(分钟) %RSD %RSD 柠檬酸 4.21 0.023 0.25 苹果酸 5.02 0.020 0.07 乳酸 6.44 0.018 0.39 甲酸 7.08 0.015 0.34 乙酸 7.67 0.013 0.53 表4糖标准溶液分析结果(n=6) 化合物名称 保留时间 保留时间 峰面积 平均(分钟) %RSD %RSD 乳糖 6.20 0.013 0.08 葡萄糖 7.10 0.055 0.09 甘露糖 8.07 0.010 0.13 果糖 8.83 0.008 0.11 校准曲线 图4所示为有机酸的标准曲线，表5为标准曲线的线性范围范围与相关系数。图5所示为糖类的标准曲线，表6为标准曲线浓度范围与相关系数。 有机酸的5个化合物及糖类的4个化合物相关系数均为R=0.9998以上，线性良好。 (mg/L) 图4有机酸的标准曲线 表5有机酸的线性范围与相关系数(R²) 化合物名称 线性范围(mg/L) R 柠檬酸 10-1000 0.9999 苹果酸 10-1000 0.9999 乳酸 10-1000 0.9999 甲酸 10-1000 0.9999 乙酸 10-1000 0.9999 图5糖类的标准曲线 表6有机酸的检量范围与贡献率(R) 化合物名称 线性范围(mg/L) R² 乳糖 10-2000 0.9999 葡萄糖 10-2000 0.9999 甘露糖 10-2000 0.9998 果糖 10-2000 0.9998 残留量评估 对有机酸(柠檬酸、乳酸)、糖(乳糖)的残留量进行了评估。清洗自动进样器时，在清洗液中加入水，将进样针内外壁清洗干净。 图6所示为有机酸的残留量评估结果，图7为糖类的残留量评估结果。结果表明，柠檬酸残留量为0.0055%、乳酸为0.0069%、乳糖为 0.0098%，残留量小，不会对定量产生影响。 黑线：100 g/L柠檬酸、乳酸混合示准水溶液 图6柠檬酸、乳酸的残留量评估 样品的预处理 在牛奶中加入酸奶，放入酸奶制造机中，在40℃温度下进行发酵，每隔一定时间取样。预处理方法如下： (1)称1g酸奶，加入5 mmol/L p-甲苯磺酸水溶液4mL和1mL氯仿； (2)振荡1分钟， 在 10000 rpm 速度下进行离心； (3)取上清液，用0.45 um 微孔滤膜过滤； (4)滤液用纯水稀释10倍，制成分析试样。 酸奶的分析 对经过一定时间后(0.0、1.0、2.0、3.5、5.5、7.0、8.5小时)的试样进行分析。 图8所示为发酵3.5小时后的样品有机酸分析色谱图，图9为同一样品的糖类分析色谱图。结果表明，柠檬酸、乳酸及乳糖有检出。 图8发酵3.5小时的酸奶中有机酸分析色谱图 图9发酵3.5小时的酸奶中糖类分析色谱图 酸奶回收率试验 取发酵3.5小时的样品加入有机酸、糖类，进行回收率试验。在预处理操作(1)中，称1g酸奶，加入5 mmol/L p-甲苯磺酸水溶液2.6 mL、400 mg/L 有机酸混合水溶液 0.7 mL、2000 mg/L糖混合水溶液0.7 mL、仿仿1mL。图10所示为有机酸添加标准液的色谱图，表7为有机酸的回收率结果，图11为糖类添加标准液的色谱图，表8为糖类的回收率结果。有机酸和糖类的回收率达到94.6-101.8%，结果良好。 图10有机酸的色谱图(红：添加标准液、黑：未添加标准液) 表7有机酸回收率结果(添加量：预处理后浓度换算结果56 mg/L) 化合物名称 有添加 无添加 回收率(%) 浓度(mg/L) 浓度(mg/L) 柠檬酸 65.9 10.0 99.8 苹果酸 57.0 未检测出 101.8 乳酸 61.4 8.4 94.6 甲酸 56.4 未检测出 100.6 乙酸 56.1 未检测出 100.3 图11糖类的色谱图(红：添加标准液、黑：未添加标准液) 表8糖类回收率结果 (添加量：预处理后浓度换算结果280 mg/L) 化合物名称 有添加 无添加 回收率(%) 浓度 (mg/L) 浓度 (mg/L) 乳糖 544.0 257.1 102.4 葡萄糖 282.4 未检测出 100.9 甘露糖 301.5 未检测出 107.7 果糖 298.6 未检测出 106.6 酸奶发酵时间进程变化试验 对经过一定一间(0.0、1.0、2.0、3.5、5.5、7.0、8.5小时)后的样品进行分析，确认了有机酸、糖类含量的时间进程变化。 图12所示为不同发酵时间下有机酸含量的变化，图13为糖类含量的变化。从结果可以发现，随着发酵的进程，乳糖发生分解，生成乳酸。 这里显示的浓度换算为酸奶原液的浓度。 结论 使用 Nexera 系列双进样系统，可以同时进行有机酸和糖类的分析。 使用该系统，可以评估酸奶发酵过程中的有机酸、糖含量的时间进程变化，对发酵进展情况进行监测。双进样系统可实现快速同时对多种化合物进行分析。 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ( http：//www.shimadzu.com.cn ) ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。如有变动，恕不另行通知。 ) 微生物分解各种物质并产出有用的物质，这个过程称为发酵。近年来，除了食品以外，发酵也被广泛运用于工业领域。为理清发酵过程并优化其条件，对有机酸、糖、氨基酸等多种化合物进行了测定，展开了多方面分析。使用HPLC法时，由于不同的化合物所适用的分离模式以及检测方法各不相同，因此需要分别单独分析。本文介绍了一种使用双进样系统监测发酵过程的分析方法，在同一个系统中同时执行两种类型化合物的分析。