配方米粉、调制奶粉、发酵乳中乳铁蛋白检测方案

婴儿奶粉中乳铁蛋白的提取与检测 背景 乳铁蛋白 (Lactoferrin)是乳清蛋白的主要成分之一，广泛分布在人和哺乳动物的乳汁中，是母乳中的核心免疫蛋白，能够帮助婴幼儿提高免疫力，促进婴幼儿的生长发育。因此，添加乳铁蛋白的婴幼儿奶粉越来越受到消费者的青睐，食品安全国家标准-食品营养强化剂-乳铁蛋白(GB1903.17--2016)也将乳铁蛋白列为营养强化剂之中，但该标准中的检测方法未经前处理，检测方法受杂质干扰大。纳谱分析提供的SelectCore Heparin 肝素亲和 SPE柱，可以快速高效的检测乳铁蛋白含量。 适用范围 该方法适用于食品安全国家标准-食品营养强化剂-乳铁蛋白(GB1903.17-2016)中测定婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方米粉、调制奶粉、发酵乳等食品中乳铁蛋白含量。 实验步骤 1、试剂准备 磷酸氢二钠溶液(0.2mol/L)：称取14.2g磷酸氢二钠，加水溶解，用磷酸调节pH 值至8.00±0.50，加水定容至500mL. 磷酸氢二钠-氯化钠溶液：：称取0.71g磷酸氢二钠，5.84g氯化钠，用磷酸调节 pH 值至 8.00±0.50， 加水定容至100 mL. 乳铁蛋白标准品：乳铁蛋白母液，浓度 10 mg/mL， 称取1g乳铁蛋白加水溶解，定容至100mL。 2、样品制备 液体试样：准确称取5g试样于50mL离心管中，加入5 mL 磷酸氢二钠溶液，涡旋震荡0.5 min， 4℃下以10000 r/min 的转速离心10 min， 将上清液转移到另一50 mL 离心管中。再加入5 mL 磷酸氢二钠溶液重复一次，合并两次上清液备用。 固体试样：准确称取1g试样于 50 mL 烧杯中，加入5 mL 温热的磷酸氢二钠溶液(温度不超过50℃)，搅拌使样品完全溶解，将样品全部转入50 mL 离心管中。再向原烧杯加入5 mL 磷酸氢二钠溶液，合并两次液体，涡旋震荡 0.5 min， 4℃ 下以10000 r/min 的转速离心10 min， 将上清液转移到另一 50 mL 离心管中。再加入5 mL 磷酸氢二钠溶液重复一次，合并两次上清液备用。 3、净化 SPE 柱活化： SelectCore Heparin 肝素亲和柱 1mL 加入 5 mL 磷酸氢二钠溶液活化； 上样：加入步骤2中制备好的上清液； 淋洗：待上清液完全流出后，再用10 mL 磷酸氢二钠溶液淋洗，弃去全部淋洗液； 洗脱：用2.5mL磷酸氢二钠-氯化钠溶液洗脱，收集全部洗脱液，用磷酸氢二钠-氯化钠溶液定容至2.5mL。将收集溶液过滤膜，供液相色谱分析。 4、液相色谱仪器条件 色谱柱： ChromCore 300 C4-T5um，4.6×250mm 检测波长：280nm 柱温：30℃ 进样体积：20pL 流速：1.0mL/min 流动相：A相：0.1%三氟乙酸水溶液；B相：乙腈 洗脱梯度： 时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(%) 流动相B(%) 0 1.000 70 30 15 1.000 40 60 16 1.000 70 30 26 1.000 70 30 图1婴幼儿奶粉未经净化和净化后的色谱对比图 图1显示，未经净化处理的婴幼儿奶粉受基质效应影响较大，并且目标峰和杂质峰的分离度较差，净化处理的婴幼儿奶粉基线稳定，并且目标物质清晰可见。 实验谱图及加标回收率数据 实验谱图 图2 0.2mg/mL乳铁蛋白标准品色谱图 76 图3 婴幼儿奶粉加标(加标量： 10mg/100g)色谱图 图4婴幼儿奶粉加标(加标量：50mg/100g)色谱图 加标回收率数据 加标量 加标回收率 10mg/100g 85.30% 50mg/100g 95.61% 由以上谱图可以看出，婴幼儿奶粉的加标回收率较好，符合检测要求。 实验心得 1.回收率好，且速度快：相比市面上常见的琼脂糖基质的肝素亲和小柱， SelectCore Heparin 采用的是单分散的聚丙烯酸酯基质，滴速更快，相同装量下滴速可以快1~2倍，加快了前处理的时间； 2.使用轻松，不惧流干：基质的机械强度高、化学稳定性好，即使小柱流干再次润湿也同样保证回收率。 小柱状态 加标量 加标回收率 未流干 1.0 mg/mL 95.33% 流干后，再次润湿 1.0 mg/mL 94.20% 纳谱分析NanoChrom纳谱分析技术(苏州)有限公司Phone： E-mail： customerservice@nanochrom.com Web： www.nanochrom.com 加标量加标回收率10mg/100g85.30%50mg/100g95.61%