多个厂家二元超高效液相色谱系统中运行长时间缓梯度时的性能检测方案(液相色谱仪)

「应用纪要]WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要1 比较多个厂家二元超高效液相色谱系统运行长时间缓梯度时的性能 Jennifer Simeone、Paula Hong和Patricia R. McConville 沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 应用优势 使用ACQUITY"UPLCMI-Class PLUS系统改善长时间缓梯度方法的保留时间重现性。 沃特世解决方案 关键词 长时间缓梯度，，二元LC性能， UPLC， ACQUITY， Empower 简介 方法开发的最终目标是获得优秀的液相色谱方法，得到可靠且可重现的分析结果。许多因素都会影响方法重现性，包括但不限于：流动相添加剂、pH、梯度斜率/时间、温度、色谱柱尺寸、填料粒径和形态，以及色谱柱的再平衡是否适合。方法稳定性还受LC系统设计的影响。系统设计通常反映为系统或模块的性能规格，它概述了获得最佳性能的条件。例如，已知对于需要使用长时间缓梯度的方法或者那些要求单位柱体积的溶剂组成变化较小的方法，使用高压二元泵可以达到最佳性能。 很多应用都需要使用长时间缓梯度。常见的应用领域包括生物分子分析(尤其是肽图分析和游离寡糖分析2)以及天然产物分析(包括传统中药分析3)。在本应用纪要中，我们通过运行通用肽图分析方法比较了三套套压二元LC系统的性能，并且着重比较了这三套系统的保留时间重现性。理想情况下，在持续数日乃至数年的分析中(具体取决于分析目的)， LC系统应始终能够确保不同进样以及不同分析之间的性能一致。此次评估将凸显ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统与其它厂家的系统相比，在运行长时间缓梯度方法时的卓越重现性。 实验 样品描述 将Waters MassPREP烯醇酶酶解标准品(P/N： 186002325)复溶于100 pL 0.1%三氟乙酸水溶液中(按照维护和使用手册操作)。当日制备新鲜样品，制备方法如下：取若干瓶标准品，用流动相A复溶，涡旋混合，然后混合所有样品。将得到的混合样品分别进样至三套LC系统进行分析。 方法条件 LC条件LC系统：厂家A二元UHPLC系统流速： 0.200 mL/min厂家B二元UHPLC系统进样体积： 10pL配备CH-A的ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统波长： 214nm检测器：厂家A和厂家B的UHPLC系统使用二极管阵列检采样速率： 10 Hz测器， ACQUITY UPLCI-Class PLUS系统使用洗针液： 25/75流动相A/流动相BACQUITY UPLC TUV检测器密封清洗液： 80/20水/甲醇样品：MassPREP烯醇酶酶解标准品色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C肽分析专用柱，数据管理130A， 1.7 um， 2.1×100 mm (P/N： 186003555)Empower 3 CDS FR2和Chromeleon"CDS， 7.2柱温：65C流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液流动相B：0.1%三氟乙酸的乙腈溶液 LC梯度： 时间 (min) %A %B 曲线 0 99 1 一 3 99 1 6 88 50 50 6 90 10 90 6 100 10 90 6 102 99 1 6 126 99 1 6 注：使用一个大型容器每日制备新鲜流动相，然后将新制流动相分配给三套系统，以降低任何潜在的差异。 分离复杂样品时，通常需要使用长时间缓梯度。肽酶解物的分离就是其中一个典型应用领域，根据原始蛋白质的大小以及酶解时所用的酶不同，得到的肽酶解物可能会相当复杂。分析高度复杂的肽酶解物时，必须分离大量色谱峰，在这种情况下，分析批次间保留时间重现性对于色谱峰追踪至关重要。任何分离的重现性都取决于诸多因素，包括样品前处理、色谱柱、LC方法条件以及所用的LC仪器等。本研究主要探讨LC仪器对重现性的影响，因此对其它所有变量都进行了控制。如需详细了解本研究所用的方案，请参阅参考文献4。 如"简介"部分所述，由于肽酶解物可能相当复杂， LC方法通常会采用非常平缓的梯度，并以较低的流速运行，以期分离出尽可能多的组分，提升方法表征性能。此外，在反相色谱分析中，即使溶剂强度发生细微变化，肽和蛋白质的保留情况也会受到强烈影响1，这是采用平缓梯度的另一个原因。分离条件刚开始时的有机溶剂比例通常比较低(低于5%)，目的是保留强极性或先洗脱的肽。本研究选择二元系统为评估对象，原因是这些二原泵采用高压混合技术，混合准确度及混合精密度均优于采用低压混合技术的同类产品。 具体而言，：二元泵的混合准确度和精密度只取决于各个泵头的流量准确度。相比之下，三元或四元混合泵的混合准确度和精密度则取决于梯度比例阀或相关装置能否始终保持稳定、正常的工作状态。鉴于以上原因，本研究选定了一组(共三套)UHPLC二元系统进行评估，包括ACQUITY UPLC I-ClassPLUS系统以及其它两家厂家的产品。 我们尽可能选择了配置相近的三套二元系统。所有系统都应用了溶剂预加热功能。带主动溶剂预加热功能的系统进行主动溶剂预加热，不带主动预加热功能的系统则进行被动溶剂预加热。本研究使用来自同一生产批次的三根色谱柱，这同样是为了避免除了LC系统本身之外，还有其它方法条件方面的差异引入任何变异性。 三套二元系统获得的色谱图见图1。三套系统的洗脱模式(或称选择性)略有差异，保留时间也有所不同。这是由三套系统各自的系统体积、梯度延迟或驻留体积、系统扩散以及混合行为差异所造成的。 图1.使用Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统(上图)、厂家A的二元UHPLC系统(中图)和厂家B的二元UHPLC系统(下图)得到的MassPREP烯醇酶酶解标准品色谱图。所有色谱图的Y轴范围均为0-0.135AU 在包括化合物鉴定在内的许多应用中， LC系统确保多次进样均可获得精确且可重现的结果的能力都非常重要。例如，只要不同进样之间的梯度稍有差异，就可能出现小幅的选择性差异。而这有可能影响色谱峰之间的分离度-特别是只能部分分离的关键分析物对或峰之间的分离度，因为即使有机溶剂比例只发生细微变化，某些肽的保留性也可能受到极大影响。因此，如果只基于保留时间或洗脱顺序进行峰分配，难度将非常大。 在这样的情况下，泵如果不具备准确且可重现的梯度性能，其后果就是分析得到的保留时间重现性不佳。对于在三套系统上均成功分离并鉴定的峰，本研究比较了八次重复进样的保留时间，并将保留时间的标准偏差(RTSD)绘制成图(见图2)。除单个峰的标准偏差以外，我们还计算了Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统、厂家A二元系统和厂家B二元系统各自分离出的所有峰的平均保留时间标准偏差，分别为0.012 min、0.062 min和0.033min 。 图2.MassPREP烯醇酶酶解标准品在不同厂家的二元系统上进行八次重复进样得到的保留时间标准偏差图。 在本研究评估的三套系统中， ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统总体上表现出最佳的保留时间重现性，该系统的平均标准偏差为0.012 min (或0.7s)。与之相比，厂家A二元系统的保留时间标准偏差最高，平均保留时间 SD为0.062 min (或3.7s)。ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统的标准偏差值非常小，证明进样之间的梯度输送一致性良好。 若缩小保留时间窗口进行研究，可以发现各系统间的重现性差异更为明显。具体而言，图3所示为时间窗口30-48 min的重叠色谱图和某一个峰的保留时间窗口的重叠色谱图。由于梯度延迟体积存在搓异，各系统的保留时间窗口有所不同。这些色谱图展示了三套系统的保留时间重现性。由ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统上所有进样的叠加色谱图可以看到，进样之间的保留时间差异非常小，较低的保留时间 SD值(0.015 min)也印证了这一点。厂家A二元系统的保留时间偏移范围更宽，正如它的保留时间 SD值(0.070 min)所示， 这表明进样之间的梯度输送性能存在差异。厂家B二元系统八次进样的保留时间标准差在上述两套系统之间，保留时间 SD为0.035min。还需指出的是，在厂家A和B的系统上观察到的保留时间偏移并未呈现出特定的趋势，而是在整个重复进样过程中随机变化(数据未显示)。 图3.在ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统(上图)、厂家A的二元UHPLC系统(中图)和厂家B的二元UHPLC系统(下图)上重复进样八次得到的叠加色谱图。右侧为各叠加图中某峰的放大图以及八次进样的保留时间标准偏差。 如前文所述，可重现地输送梯度对于峰鉴定和峰追踪而言非常重要。输送梯度的准确度也很重要，可确保无论何时运行开发的方法，其性能都能保持一致。图4所示为同一烯醇酶酶解物样品在厂家B的二元系统上执行两次连续进样，并采用相同方法条件运行分析得到的色谱图。色谱图1a和2aB(左图)展示了梯度早期的洗脱行为，而色谱图1b和2b(右图)展示了梯度后期的洗脱行为。 在左上方的色谱图中(1a)，有两个峰分别在约14.15 min和14.25 min处洗脱。然而，在下一次进样中(2b)，约14 min处只有一个峰洗脱。仅凭该信息，无法将色谱图2a中的这个峰与色谱图1a两个峰中的任何一个对应起来。梯度早期所有峰(2a)的的留时间都显示出偏早的趋势，而且关键分析物对之间有分离度损损(红色框)。然而，梯度结束时(1b和2b)，所有峰的保留时间又恢复了较为一致的状态。任何影响色谱分离的梯度输送不一致都可能导致含糊或不正确的结果，最终导致分析人员不得不额外采集数据。这不仅影响数据质量，还会增加获得最终结果的工作量。 图4.在厂家B的二元UHPLC系统上连续两次进样的结果。左侧色谱图(1a和2a)显示进样1与进样2得到了不同的保留窗口，而右侧色谱图(1b和2b)显示进样1与进样2得到了相同的保留时间窗口。 结果与讨论 运行分析方法时，LC系统的性能和重现性会影响色谱峰的鉴定、定量以及追踪。不仅如此，诸如长时间缓梯度这样高难度的方法条件也可能对保留时间重现性产生不良影响。本研究评估了ACQUITY UPLC I-ClassPLUS系统和其它两家厂家的二元UHPLC系统在运行长时间缓梯度方法分离复杂样品时的性能。ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统形成梯度的一致性最佳，因此能够生成可重现的保留时间，从而获得高质量且可重现的数据。 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters、The Science of What’s Possible、ACQUITY、UPLC、Empower和MassPREP是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 ( 参考文献 ) 1.M Swartz， IKrull. Validation and Peptide Mapping.LCGC North America， 25(2007) pg 468-475. 2. MA Lauber，SM Koza，EE Chambers.Comprehensive Characterization of the N andO-Linked Glycosylation of a Recombinant HumanEPO. Waters Application Note 720005462EN 2015. 3.SS Nikles， Monschein， H Zou， Y Liu， XHe， D Fan，A Lu， K Yu， GIsaac， R Bauer. Metabolic Profilingof the Traditional Chinese Medicine FormulationYu Ping Feng San for the Identification ofConstituents Relevant for Effects on Expressionof TNF-a，IFN-y，IL-1β and IL-4 in U937 cells.J Pharm and BioMed Anal.， 145(2017)， pg.219-229. 4. JSimeone， P Hong， P McConville. Performanceof the ACQUITY UPLCI-Class PLUS System forMethods Which Employ Long，Shallow Gradients.Waters Application Note 720006290EN 2018. 扫一扫，关注沃特世微信 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-5209 3866 上海：021-61562666 广州：020-28296555 香港：852-29641800 超高效液相色谱系统性能比较 应用优势 使用ACQUITY™ UPLC™ I-Class PLUS系统改善长时间缓梯度方法的保留时间重现性。简介 方法开发的最终目标是获得优秀的液相色谱方法，得到可靠且可重现的分析结果。许多因素都会影响方法重现性，包括但不限于：流动相添加剂、pH、梯度斜 率/时间、温度、色谱柱尺寸、填料粒径和形态，以及色谱柱的再平衡是否适合。 方法稳定性还受LC系统设计的影响。系统设计通常反映为系统或模块的性能规格，它概述了获得最佳性能的条件。例如，已知对于需要使用长时间缓梯度的方法或者那些要求单位柱体积的溶剂组成变化较小的方法，使用高压二元泵可以达到最佳性能。很多应用都需要使用长时间缓梯度。常见的应用领域包括生物分子分析（尤其是肽图分析1和游离寡糖分析2）以及天然产物分析（包括传统中药分析3）。在本应用纪要中，我们通过运行通用肽图分析方法比较了三套高压二元LC系统的性能， 并且着重比较了这三套系统的保留时间重现性。理想情况下，在持续数日乃至数年的分析中（具体取决于分析目的），LC系统应始终能够确保不同进样以及不同分析之间的性能一致。此次评估将凸显ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统与其它厂家的系统相比，在运行长时间缓梯度方法时的卓越重现性。结果与讨论 运行分析方法时，LC系统的性能和重现性会影响色谱峰的鉴定、定量以及追踪。不仅如此，诸如长时间缓梯度这样高难度的方法条件也可能对保留时间重现性产生不良影响。本研究评估了ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统和其它两家厂家的二元UHPLC系统在运行长时间缓梯度方法分离复杂样品时的性能。ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统形成梯度的一致性最佳，因此能够生成可重现的保留时间，从而获得高质量且可重现的数据。