超高效液相色谱中更高的分析通量检测方案(液相色谱仪)

从HPLC到UPLC的方法转换以适应更高的分析通量 一个典型的HPLC分析方法成功地转换并优化为Waters ACQUITY UPLCTM方法，既达到了样品分析的高通量又得到更高的分析灵敏度。提出了进一步快速转换方法的策略。对运行成本和样品通量的分析表明：UPLC的成本优势要超过HPLC。 日益增长的制药行业大批量样品分析的需求，促进了ACQUITY Ultra Performance LC (UPLCTM)的研制和开发。这个系统之所以能够提供如此快速的分析，得益于它采用了小颗粒杂化填料(1.7µm)，它具有极好的分离度和奇特的化学特性。(1-5) 为了与这种小颗粒杂化填料相匹配，实现快速分析，Waters公司在普通液相色谱的基础上，从色谱柱到色谱系统都进行了大幅度改进。要实现真正的超高效液相色谱分离，UPLC仪器系统必须耐高压（高达15000psi）、死体积小，且检测器的数据采集速率要大大提高以与高速流出的色谱峰匹配。新型的针内针设计真正地防止了交叉污染，极大地提高了检测灵敏度。 在本文中，一个用于质量控制（QC）的HPLC方法被优化为UPLC方法，目的是减少总运行时间，降低分析成本和增加仪器正常运行时间。 方法的开发 初始的HPLC方法为：分析时间：10分钟，样品：溶于有机溶液中的杂环药物（Cpd A）。加入内标以补偿样品前处理所造成的损失，采用梯度是必要的，目的是清洗后面流出的干扰物。 从普通HPLC方法转换为UPLC方法，开始仅仅是将流动相流速、进样体积进行简单的换算。换算因子由色谱柱横截面积的比率得到，以保持相同的线速度。 从UPLC得到的色谱峰是非常窄的，超凡的分离度表明方法尚有改进的余地。原来认为：只要柱反压允许，流动相的流速可以随意提高。但是后来对色谱柱寿命的研究表明，用提高流动相中的有机相含量的方法来缩短分析时间似乎更经济合算，溶剂的消耗也大大减少。 图（1）显示的是由最初HPLC方法通过简单的按比例缩小得到的UPLC色谱图。最下面的是经过优化的UPLC色谱图。表‎Ⅰ列出了HPLC及UPLC方法具体的色谱条件及药物分析结果 。 方法优化指南及探讨 在优化UPLC方法时除要考虑方法转换的速度外，还应考虑以下几点：  利用UPLC高分离度的优势，增加流动相的强度，可以缩短分析时间。（见表Ⅱ）  对延长色谱柱寿命来说提高流动相的流速不如增加溶剂强度。虽然，UPLC可以做到在高流动相线速度下仍保持良好的分离度。然而，对于任何柱子，经常在80%最大流速压力下运行都会减少色谱柱的寿命。（见图2）。依据我们的经验，与HPLC相比，UPLC在反压达到8000psi时柱损耗还是比较低的。尽管与传统的HPLC相比，UPLC的损耗已经很小（比HPLC降低了一个数量级），但是若尽可能地保持低流速，还可以进一步减少溶剂的损耗和废液的处理费用。  由于UPLC的系统体积很小，可以减少色谱柱的再平衡时间。流动相的变化需要一定的时间才能到达色谱柱。UPLC极低的系统体积（110µL，仅为HPLC的15%)允许进一步缩短分析时间。在UPLC上，当下一个样品进样时，色谱柱已达到了再平衡。它使得分析通量进一步提高。  根据色谱柱的内径，适当地减小进样体积，可以得到更好的峰形。当过量的强溶样溶剂加到色谱柱头时，色谱峰会分叉。UPLC一般最大允许进样体积为5µL，依据我们的经验，一般采用1-3µL。值得一提的是：由于UPLC色谱柱的分离度高、进样器的交叉污染很低，这么小的进样量也会得到理想的峰高、达到相当或更低的LOQ（测试结果表明：UPLC的交叉污染仅为HPLC的10%）。另外，小体积进样还可以降低样品溶剂的强度，使得样品在柱头集中进样。  尽量先试用部分定量环进样方式，如图（3）所示：即使当进样体积达到定量环的80%时，部分定量环进样都能得到很好的精密度。在传统的HPLC检测中，一般进样量的体积都是控制在定量环体积的50%左右。UPLC的进样系统用两段气隙将样品夹在中间，能更好地利用定量环且精密度更好。这种进样方式比满定量环进样方式更节省样品。从实验的角度来看,满定量环进样需要足够多的样品才能实现充满定量环的功能。这样可能要增加随后的洗针，将会影响样品通量和加大洗针硬件的磨损。大体积的样品转换也增加了样品颗粒析出的可能性，影响仪器的长期可靠性。   如果想采用满定量环进样方式(也许是为了满足非常高的精密度的要求)，则要保证样品在定量环内充分溢出。在很窄的UPLC进样管线内，样品在管壁边的流速和在管中心的流速是不同的。采用满定量环进样，至少要用四倍定量环体积的样品溢流定量环，以确保样品将洗针液从5µL定量环中置换掉。UPLC仪器在出厂时对每一种规格的定量环都用典型的样品溶剂测试并设置了优化的溢流体积作为缺省值。对于某些特别的样品成分，分析者也可以另外设置相应的溢流体积。  选择合适的弱洗针液和弱洗针液的用量，可以得到更窄的色谱峰形。在采用部分充满定量环进样方式时，会有部分弱洗针液与样品相伴进入色谱柱。因此，弱洗针液的组成要与流动相初始组成条件一致。利用弱洗针液作为定量环内样品的稀释液能够使样品在色谱柱头上富集，防止样品扩散。设置弱洗针液体积时要注意，所用弱洗针液的体积要足够大，要能将前面所用的强洗针液充分替换出去。 初步的方法验证 初步的评估包括对分析方法和仪器进行线性范围、精密度、准确度、系统适用性，和样品的交叉污染的考察。 线性和最低定量限（LLOQ） UPLC的灵敏度很高，定量范围很广（1—500倍）。用同一个UPLC分析方法校正，可以得到两个不同范围的线性标准曲线。（见图4和5）。具有54ng/mL定量限（LLOQ）的UPLC 低范围的分析方法可用于更有特色的LC/MS分析。特别要指出，这台UPLC配置的是PDA检测器。如果用单波长检测器可以得到更低的定量限。 精密度和准确度 在每个指定浓度下，进样三次，以测定其精密度（重复性）和准确度。利用峰面积的相对标准偏差来衡量仪器的精密度（RSD）。准确度是利用峰面积的标准曲线来计算每一个样品的含量，再与理论值相比，以百分比的形式给出。结果高、低两种浓度的精密度、准确度均符合要求。（见表Ⅲ和Ⅳ） 系统适用性 同一样品连进五针，用以考察系统的适用性。结果均达到USP要求。（见表Ⅴ） 两次进样之间的交叉污染 上一样品的残留会对下一针样品产生污染(交叉污染)，它将直接影响方法的LLOQ。交叉污染还会导致仪器精密度、准确度和系统适用性检测的失败。然而，从详细的研究来看，没有显示出明显的交叉污染的影响。此处将浓样和稀释样品混合编组直接测量交叉污染,期望会出现因交叉污染导致的结果不准确。 UPLC采用了神奇的针内针设计，两套独立的进样器清洗系统，极大地减少了交叉污染的机会。在本实验中，我们采用了200µL的甲醇作为强洗针液，用以除去大部分有机残留物。接下来再用600µL的水：乙腈（90：10）置换强洗针液，使得定量环、进样针、阀内充满了与方法的初始条件一致的溶剂。 交叉污染的测定可以通过在检测完标准样品后，检测其溶剂空白值得到。本实验中，在检测5次低浓度标准样品后检测的空白值为未 检出。检测完最高浓度标样后检测空白，发现有些微小的相关峰，其面积是上一针标样的0.01%,这是可以接受的。然而，还可以通过优化清洗液的设定来进一步消除交叉污染。作为对照， HPLC的交叉污染比UPLC高出5-10倍。 结论 本实验将有机溶剂萃取液中的杂环药物的QC HPLC定量方法成功地转换并优化为UPLC方法。初步实验表明该方法可以被验证。总结了如何加速开发UPLC方法的指南。UPLC的应用具有成本优势。对于每一个分析任务来说，UPLC的色谱柱消耗与HPLC相当甚至更 低一些，其溶剂的损耗、废液的处置费用比传统的HPLC要小一个数量级。ACQUITY UPLCTM的分析时间减少了5倍，令人瞩目地提高了仪器的投资回报率并降低了对仪器(假如只配置HPLC)总台数的需求。 图1 ：从上往下：原来的HPLC色谱图；通过简单的缩放得到的UPLC色谱图（峰形变窄）；优化过的UPLC色谱图。峰1:内标；峰2：CpdA 图2：由UPLC实验数据得到的van Deemter 曲线表明，用提高流速来减少总运行时间是一个似是而非的策略。这要权衡反压对色谱柱寿命的影响（见正文） 图3：利用UPLC标称5μL (实际4.8μL)的定量环，以部分充满环进样方式，得到的峰面积与进样体积的关系图。 对于一般的部分充满定量环进样，线性范围仅为进样环的40-50%。 图4：低浓度（0.054-1.30µg/mL）时浓度和峰面积之间的线性关系。（R2=0.996 ；1/X2权重） 图5：高浓度（0.325—25.8µg/ml）时浓度和峰面积之间的线性关系。（R2=0.999967 ;1/X2权重）