使用质谱和UV的色谱系统简化峰追踪和共流出检测

[应用纪要] Paula Hong and Patricia R McConville沃特世公司 应用优势 ■结合质谱和UV光谱分析，可以在单次运行中同时实现峰追踪和共流出峰的鉴定 与ACQUITY UPLC H-Class四元系统结合的灵活软件可通过Auto·Blend Plus调节流动相pH值 此软件可在同一个工作流程中分析UV和质谱数据，从而简化数据分析过程 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC H-Class系统和AutoBlend Plus ACQUITY UPLC PDA检测器 ACQUITYQDa检测器 Empower3软件FR2 关键词 峰鉴定，共流出峰，四元溶剂管理理，Auto·Blend Plus，镇痛药 反相液相色谱(I(RPLC)分离方法的开发通常需要很多耗时步骤，包括大量的数据处理过程。许多筛选方案都依赖于UV检测，但单一的检测技术无法提供充分的丢失峰和共流出峰信息。 使用质谱检测器很难区分同量异位化合物。此外，由于背景干扰，微量化合物可能会丢失，一些重要的样品组分也可能无法离子化。不含发色团的化合物无法进行UV峰追踪，因此光谱无法可靠的进行辨别。发生共流出时，通常较难识别谱图中哪些光谱被“累加”。而当浓度存在非常较大的差异时，共流出物中微量化合物的谱线可能会完全消失。最后，尤其是当pH值发生变化时，UV光谱容易受溶剂化显色效应的影响而改变。这些都说明了使用单一检测技术进行方法开发的困难性。 为应对这些挑战，，可以使用多种检测器来对单个样品进行分析，每种检测技术分别针对不同理化特性的分子。将检测器响应整合到一个软件界面中，就可以通过精简的平台简化数据分析。 实验 样品描述 镇痛药组合包含乙酰水杨酸、对乙酰氨基酚、2-乙酰氨基酚、乙酰苯胺、非那西汀和咖啡因，采用90：10的水/乙腈混合溶液配制，浓度为0.2 mg/mL。 UPLC条件LC系统：ACQUITY UPLC H-Class系统，波长：245 nm配备ACQUITY等度溶剂管采样速率：20点/秒理器(ISM)时间常数：正常(0.1s)UV检测器：ACQUITY UPLC PDAISM溶剂：含0.1%甲酸的90：10色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C1水/乙腈1.7 um，2.1×50 mmISM分离：10 (UPLC)柱温：30℃ISM流速：0.5 mL/min样品温度：20℃进样体积：1pl溶剂A：125mM甲酸的水溶液溶剂B：125mM氢氧化铵水溶液MS条件质谱溶剂C：乙腈检测器：ACQUITY QDa溶剂D：水电离模式：ESI+，ESI-组成：使用AutoBlendPlus制备采集范围：100-250m/z清洗溶剂：50：50水/乙青采样速率：5点/秒(含0.05%甲酸)毛细管电压：0.8kV洗脱溶剂：90：10水/甲醇锥孔电压：10V密封清洗液：90：10水/甲醇探头温度：600℃流速：0.6 mL/min梯度：乙腈在0.5分钟内从2%增加色谱数据管理至10%，在0.3分钟内从10%增加至50%Empower 3 FR2 结果与讨论 在下面的研究中，我们利用配有ACQUITY QDa和ACQUITY UPLC PDA检测器的ACQUITY UPLC H-Class系统对一份镇痛药混合物进行分析。使用Empower3作为操作软件。初始筛选试验结果表明，在流动相pH为5时，六种标准品组分中有五种实现了分离(图1) 图1.镇痛药样品在pH=5， UV245nm波长下的UV谱图。 为了在分离中进行峰追踪以及确定是否存在共流出物，本实验分别对质谱和UV的光谱数据进行了分析。质谱数据用于识别混合物中具有独特质量数的组分。例如，峰4可以初步鉴定为乙酰苯胺 (m/z136.0)，峰5为非那西汀 (m/z180.0)。峰3存在于负离子模式下，也可根据其独特质量数鉴定为乙酰水杨酸 (m/z 137.0处的碎片离子)。如要区分峰1和峰2，还需对质谱和UV光谱数据进行进一步研究。 混合物中存在两种同量异位化合物(对乙酰氨基酚和2-乙酰氨基酚)，其单一同位素质量数为152.1。在分离中(图1)，峰1和2均含有对应的质量数。由于峰2还包含其他的主要分子离子，说明峰2可能存在共流出。因此，为了确证鉴别结果，除需要进行UV检测及追踪同量异位化合物的谱峰外，还需要将组分从峰2中完全分离出来。 为评估峰2的纯度，本文引用了Empower 3软件中的质量数分析窗口(图2)。1.3min处峰的评估结果显示峰前沿处存在有m/z 152和m/z110(图3)。相反，峰拖尾处显示有全部三个质量数，同时与峰顶点有不同的离子比率。三种离子的存在表明有多个分析物同时洗脱。具体来说，离子比率的不同和峰前沿m/z 195的缺失表明仅有部分色谱分离。如果该比率在所有时间段保持不变，则碎片很可能来自离子源。鉴于混合物的已知组份，可确定拖尾峰的主要质量数来自咖啡因(m/z195.0)。峰前沿包含了同量异位化合物(2-乙酰氨基酚或对乙酰氨基酚)的两个母离子以及共有碎片离子m/z110.0。 图2.Empower 3质量数分析窗口中镇痛药混合物的质谱和UV光谱组合视图。所有质量数顶点谱图都含有一个主要质量数(峰2除外)，显示出三个主要离子。 图3.Empower 3中的峰纯度视图，峰2的质量数和UV光谱数据显示在质量数分析窗口中。对峰的前沿、顶点和拖尾部分进行比较，结果显示离子比率不同，提示存在共流出物质。 为提高峰2中共流出物的分离度，实验对流动相pH值的影响进行了评估。使用设计灵活的软件，通过AutoBlend Plus以pH为单位直接输入反相梯度。此过程可以在无需制备新缓冲液瓶的情况下实现对pH的控制。 流动相pH值的增加改变了两个共流出化合物的选择性(图4)。当pH为6时，咖啡因(峰B)被认为是两个未分离峰中较晚洗脱物的主要质量数(m/z 195) 来源。pH为7时，两种物质实现基线分离，其中咖啡因(峰B)较晚洗脱， 峰A在1.2min洗脱。 图4.流动相pH值对峰2分离度的影响。流动相pH值越高，咖啡因与2-乙酰氨基酚之间的分离度越高。在pH为7时实现基线分离。 图5.Empower 3中的峰纯度视图。，“质量数分析”窗口中显示了同量异位化合物的质量数和UV光谱数据。可根据UV谱图对同量异位化合物进行鉴别。 [应用纪要] 其中一种同量异位化合物(峰A)与咖啡因(峰B)在流动相pH为7时实现基线分离(图4)，因此可以使用UV谱图对两种同量异位化合物进行峰追踪。虽然峰1(图1)和峰A(图4)的主要质量数相同，但峰A包含碎片离子m/z 110(图5)。将同量异位化合物的质量数和UV谱图进行比较，可以得到峰鉴定所需的信息：峰1的UV谱图对应的是对乙酰氨基酚介(最大波长为243nm)。因此，后洗脱的峰A可确定为2-乙酰氨基酚。 使用单一检测技术进行方法开发是一项比较困难的挑战，UV谱图数据有助于进行峰纯度评估和鉴定，但如果存在共流出物，峰追踪就难以实现。质谱数据可针对少数化合物实现色谱峰匹配，但如果存在同量异位化合物，就需要更多信息才能进行谱峰确证：无论是想要立即获取UV鉴定结果还是更可靠的分析定量，完整的分离都是最基本的要求。 通常情况下，需要进一步的分析才能对这些现象――鉴别。为简化方法开发，.可使用UV和质谱检测与精简的软件平台相结合的色谱系统，以实现峰纯度评估，有助于在单次运行中鉴定共流出物质。 ( 参考文献 ) ( 1. M anion JA et al. N IST Standard Reference Database 17. I n NI S T Chemical Kinetics Database， National Institute of Standards and T echnology： Gaithersburg， Maryland， 20899-8320，2008； Vol. Version 7.0 (Web Ve r sion). ) ( 2 . C havali A， Wheat TE， McConville PR . In A u tomating pH Man i pulation i n Reversed-phase Method Development， 39t h InternationalSymposium on High-Performance-Liquid-Phase Separations andRelated Techniques ， Amsterdam， the Netherlands， Ju n e 16-2 0 ，2013；Waters Corporation， Poster： Amsterdam， the N e therlands， 2013. ) 沃特斯中国有限公司沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28296555 ( 成戈：028-65545999 ) 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400)8202676www.waters.com 使用质谱和UV光谱数据与Empower 软件相结合的色谱系统简化峰追踪和共流出检测