人血清中游离胆汁酸检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-940Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-387 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996 http：//www.shimadzu.com.cnBuilding C801， No.180 Yizhou Road， Shanghai Hotline： 021-34193996 应用 LCMS-8050 CL 检测人血清中多种游离胆汁酸含量 LCMSMS-387 摘要：本文应用岛津液相色谱三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL 及人血清中多种胆汁酸检测试剂盒(高效液相色谱-串联质谱法)，建立了同时测定人血清中15种游离胆汁酸含量的方法。使用试剂盒的内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法专属性良好，标准曲线相关系数均大于0.99，准确度及精密度均满足剂剂盒要求。该方法对肝胆功能相关疾病的临床诊断、治疗管理和生理评估具有重要的意义。 关键词： LCMS-8050 CL 游离胆汁酸人血清 胆汁酸，为胆汁的主要有机成分，是几种结构类似的类固醇酸的统称，由一个含四元环的甾核、一个末端为羧酸的5-8个碳侧链以及数目和方向不等的羟基组成。其是人体脂肪代谢的必需物质，在体内具有重要的生理功能，包括乳化脂肪、产生胆汁、防让胆结石等。肝胆疾病引起胆汁酸的肝肠循环障碍，是血清胆汁酸异常的主要因素，而血清胆汁酸 谱的变化亦会澋响到肝脏对胆汁酸的合成和分泌。故血清胆汁酸是衡量肝胆功能正常与否的重要标志物。 本文使用岛津液相色谱三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL 及人血清中多种胆汁酸检测试剂盒(高效液相色谱-串联质谱法)，建立了人血清中游离胆汁酸的含量测定方法，该方法分析速度快，灵敏度高，专属性强，，可供相关人员参考。 I实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津临床用超高效液相色谱仪 LC-30A CL 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL联用系统。具体配置为 LC-30AD CL×2(输液泵)， DGU-20A5RCL(在线脱气机)， SIL-30ACMP CL (自动进样器)，CTO-30A CL(柱温箱)， CBM-20A CL系统控制器， LCMS-8050 CL三重四极杆质谱仪， LabSolutionsVer. 5.91 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱 ：游离胆汁酸专用色谱柱(试剂盒提供) 流动相 ：流动相A流动相B(试济盒提供) 流速 ：0.5 mL/min 柱温 ：40℃ 进样量 ： 5 p L 洗脱方式 ：梯度洗脱，B相初始浓度为50%，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.10 Pumps Pump B Conc. 50 9.00 Pumps Pump B Conc. 80 10.50 Pumps Pump B Conc. 80 10.51 Pumps Pump B Conc. 50 13.00 Controller Stop 质谱条件： 分析仪器 ： LCMS-8050 CL DL 温度 ： 300℃ 离子源 ： ESI(-) 加热模块温度 ： 500℃ 雾化气流速 ：3.0L/min 干燥气流速 ：： 10.0 L/min 加热气流速 ：10.0L/min 扫描模式 ：多反应监测(MRM) 接口温度 ： 400℃ MRM参数 ：见表2 表 2MRM 参数 名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) CA 407.50 407.50 15.0 34.0 20.0 CA_d5 412.00 412.00 15.0 34.0 20.0 DCA 391.40 391.40 21.0 34.0 23.0 CDCA 391.40 391.40 19.0 11.0 20.0 UDCA 391.40 391.40 25.0 15.0 13.0 DCA_d5 396.50 396.50 14.0 35.0 15.0 LCA 375.40 375.40 30.0 17.0 12.0 LCA_d4 379.20 379.20 14.0 22.0 15.0 GCA 464.40 74.00 25.0 43.0 25.0 GLCA 432.40 74.05 23.0 38.0 26.0 GDCA 448.50 74.05 16.0 45.0 27.0 GUDCA 448.50 74.05 13.0 39.0 26.0 GLCA_d4 436.40 74.00 23.0 39.0 26.0 TCA 514.50 124.10 20.0 54.0 10.0 TCA_d5 519.50 124.10 20.0 54.0 10.0 TLCA 482.50 124.10 10.0 52.0 10.0 TLCA_d5 487.50 124.10 10.0 52.0 10.0 TCDCA 498.50 124.10 10.0 52.0 10.0 TCDCA_d5 503.50 124.10 10.0 52.0 10.0 GCDCA 448.50 74.05 23.0 39.0 25.0 TDCA 498.50 124.05 10.0 55.0 10.0 TUDCA 498.50 107.05 10.0 55.0 18.0 TUDCA_d5 503.40 107.05 10.0 55.0 18.0 1.3标准品、质控品及样品制备 前处理操作步骤： 将待测样本、校准品、质控品、提取液、转化液和复溶液取出放置室温(23±2)℃并混匀；分别取待测样本、校准品、质控品、空白样本各100 uL于EP管中，加入内标提取液500pL， 涡旋混匀(2500 rpm，5 min)； 离心(13000 rpm， 10 min)； 取上清液400pL于96孔板中，60℃氮气吹干；加入复溶液1(F2)100uL，将96孔板放置在微孔板恒温振荡器中700 rpm 混匀10 min，转移96孔板中的复溶液到专用过滤板中，过滤板下放置96孔进样板，将上下两个96孔板放置于多管自动平衡离心机中进行过滤，离心(4000 rpm，1min)，用96孔板进样板收集滤液，待检。 I结果讨论 2.1MRM 色谱图 图1标准曲线最低浓度点色谱图 2.2线性关系 采用内标法建立标准曲线结果如表3所示。结果显示，15种胆汁酸在线性浓度范围内线性相关性良好，相关系数均在0.99以上。 表3标准曲线结果 目标物 线性方程 线性范围(nmol/L) 相关系数 准确度(%) CA Y=(0.00326648)X+(-0.00154006) 20~2000 0.999 98.5~101.4 DCA Y=(0.000438377)X+ (0.00316078) 40~4000 0.999 98.8~101.3 CDCA Y=(0.000295700)X+(0.00100965) 40~4000 0.999 99.0~100.9 UDCA Y=(0.000491301)X+(0.000972102) 20~2000 0.999 99.2~100.9 LCA Y=(0.000603775)X+(0.00208389) 30~3000 0.999 99.7~100.4 GCA Y=(0.000563305)X+(-0.00403582) 30~3000 0.999 97.7~102.0 GLCA Y=(0.00111805)X+(0.00135653) 10~1000 0.999 99.6~100.6 GDCA Y=(0.000800769)X+(-0.00143658) 10~1000 0.999 98.8~101.3 GCDCA Y=(0.00165137)X+(-0.0100881) 100~10000 0.998 93.7~105.7 GUDCA Y=(0.00113495)X+(-0.00216187) 20~2000 0.999 98.9~101.2 TCA Y=(0.00232753)X+(-0.00308800) 6~600 0.999 97.3~102.5 TLCA Y=(0.0139655)X+(-0.00464660) 2~200 0.999 96.5~103.1 TDCA Y=(0.000700495)X+ (0.00129712) 10~1000 0.999 98.4~101.5 TCDCA Y=(0.00119082)X+(0.00343788) 10~1000 0.999 98.2~101.6 TUDCA Y=(0.000933184)X+(0.000436855) 5~500 0.999 96.2~103.5 2.3质控样本准确度及精密度考察 按1.3中的前处理方法和1.2中的分析条件对试剂盒中的高低质控品进行分析，每个样品平行处理分析6次，质控品的准确度结果如表4及表5所示，结果显示质控品测定结果与理论值接近，完全符合试剂盒质控品准确度70%~130%的要求。低浓度质控品15种胆汁酸测定结果准确度在90.9%~107.4%之间，高浓度质控品15种胆汁酸测定结果准确度在88.6%~113.8%之间。低浓度质控品15种胆汁酸测定结果(平行处理6份) RSD 在2.6%~5.8%之间，高浓度控控品15种胆汁酸测定结果(平行处理6份) RSD在2.0%~6.2%之间。 表4高质控准确度及精密度考察结果 (n=6) 编号 名称 高质控理论值 (nmol/L) 高质控测定平均值(nmol/L) 平均 准确度(%) RSD (%) 1 CA 774.9 771.1 99.5 3.4 2 DCA 1556.5 1510.8 97.1 2.7 3 CDCA 1502.2 1470.2 97.9 2.6 4 UDCA 760.8 748.7 98.4 2.3 5 LCA 1151.7 1120.1 97.2 3.2 6 GCA 1153.3 1021.8 88.6 3.6 7 GLCA 389.1 385.2 99.0 2.0 8 GDCA 378.7 357.1 94.3 3.7 9 GCDCA 4251.5 4165.8 98.0 4.6 10 GUDCA 759.1 700.2 92.2 4.7 11 TCA 227.9 241.4 105.9 6.2 12 TLCA 74.7 75.3 100.7 4.4 13 TDCA 361.7 384.6 106.3 4.5 14 TCDCA 397.1 452.0 113.8 2.6 15 TUDCA 192.0 187.6 97.7 4.1 表5低质控准确度及精密度考察结果(n=6) 编号 名称 低质控理论值 (nmol/L) 低质控测定平均值(nmol/L) 平均 准确度(%) RSD(%) 1 CA 103.0 102.2 99.2 3.2 2 DCA 208.0 196.7 94.6 4.3 3 CDCA 197.1 196.6 99.7 4.7 4 UDCA 100.9 100.9 100.0 4.9 5 LCA 152.5 150.8 98.9 4.3 6 GCA 151.8 139.1 91.7 4.4 7 GLCA 51.0 49.8 97.5 2.6 8 GDCA 51.0 49.2 96.6 3.9 9 GCDCA 493.8 499.5 101.1 3.9 10 GUDCA 100.2 91.4 91.3 4.9 11 TCA 29.4 29.9 102.0 4.8 12 TLCA 10.2 9.3 91.0 4.5 13 TDCA 47.2 50.7 107.4 5.8 14 TCDCA 50.0 48.4 96.8 5.0 15 TUDCA 24.4 22.2 90.9 5.5 2.4临床样品测定结果 取三份人血清样品，按1.3中的前处理方法及1.2中的分析条件进行测定，结果见表6。 表6人血清临床样品检测结果(nmol/L) 目标物 Sample-001 Sample-002 Sample-003 CA 107.6 20.8 102.4 DCA 754.1 885.1 38.4 CDCA 699.8 573.7 729.9 UDCA 516.5 482.4 433.6 LCA 11.3 89.0 6.0 GCA 473.4 55.1 297.2 GLCA 18.5 16.3 0.7 GDCA 1，473.0 112.6 80.2 GCDCA 1，220.2 269.7 740.8 GUDCA 325.6 45.3 644.8 TCA 27.6 23.0 36.4 TLCA 4.5 2.5 0.4 TDCA 213.4 42.5 12.0 TCDCA 120.0 92.8 108.6 TUDCA 5.7 3.0 13.9 ■细I结论 本文使用岛津临床用液相色谱三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL 及人血清中游离胆汁酸检测试剂盒(液相色谱-串联质谱法)，建立了人血清中15种游离胆汁酸同时测定的方法。使用试剂盒的内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数均大于0.99，准确度及精密度均满足试剂盒要求。该方法对肝胆功能相关疾病的临床诊断、治疗管理和生理评估具有重要的意义。 Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 本文使用岛津临床用液相色谱三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL及人血清中游离胆汁酸检测试剂盒（液相色谱-串联质谱法），建立了人血清中15种游离胆汁酸同时测定的方法。使用试剂盒的内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数均大于0.99，准确度及精密度均满足试剂盒要求。该方法对肝胆功能相关疾病的临床诊断、治疗管理和生理评估具有重要的意义。