饲料中丁基羟基茴香醚、二丁基羟基 甲苯、乙氧喹检测方案(气相色谱仪)

：34ESARe FILmi365755.006.257.508.7510.001.262.503.755.0062504 气相色谱法同时测定饲料中的丁基羟基茴香醚、二丁基羟基 甲苯、乙氧喹 Determination of butyl hydroxyl anisole， dibutyl hydroxyltoluene and ethoxyquin in feeds by GC-FID 吕建霞余翀天 赛默飞世尔科技(中国) 关键词：单四级杆质谱仪；抗氧化剂；TG-5色谱柱 Keywords： mass spectrometer； antioxidants； TG-5 column 目标 建立高效的气相色谱检测方法，灵敏、快速、同时测定饲料中的三种抗氧化剂的含量样品中的抗氧化剂经乙腈提取，分散固相萃取的方法净化，气相色谱仪分析 引言 抗氧化剂即为防止或延缓饲料中某些活性成分发生氧化变质而添加于饲料中的制剂。主要用于含有高脂肪的饲料，以防止脂肪氧化酸败变质，也常用于含维生素的预混料中，它可防止维生素的氧化失效。我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760—1996)中规定：丁基羟基茴香醚可用于食用油脂、油炸食品、干鱼制品、饼干、方便面、速煮米、果仁罐头、腌腊肉制品、早餐谷类食品，其最大使用量为 0.2g/kg。，丁基羟基茴香醚与二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯混合使用时，其中丁基羟基茴香醚与二丁基羟基甲苯总量不得超过 0.1 g/kg，没食子酸丙丙不得超过 0.05 g/kg(使用量均以脂肪计)。此外也可用于胶姆糖配料。 目前饲料中的抗氧化剂的测定方法主要有高效液相液谱法[1]、、气相色谱法[2]等。相关国家标准方法为 GB/T 17814-2011饲料中丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、乙氧喹(EQ)和没食子酸丙酯(PG)的测定。由于没食子酸丙酯的化学性质决定了该物质不适用于气相色谱法测定，故该标准中未将 PG列入气相色谱法的检测项目中。本方法依据该标准方法，开发了饲料中的三种抗氧化剂的同时测定的方法，对前处理方法做了少许改动，以增强该方法的适用性。 仪器 Trace1310 气相色谱仪，配 FID 检测器(Thermo Scientific)； AS1310 自动进样器(ThermoScientific) 离心机、天平、漩涡混合器(Thermo Scientific) 耗材 色谱柱： TG-5MS(30 mx0.25 mmx0.25 um) (Thermo Scientific， PN 26098-1420) C18 吸附剂：40-60 um。 (Thermo Scientific) 试剂与标准品 丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、乙氧喹标准品：：含量≥99%； 乙腈、正己烷：色谱纯(Thermofisher)；氯化钠，分析纯 标准溶液的制备 储备液：准确确取10.0mg丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、乙氧喹标准品，分别用正己烷溶解稀释并定容至10mL， 得到 1000mg/L 标准储备液，储存在冰箱中备用。 标准中间液：上述储备液分别移取1mL，用正己烷稀释定容至100mL，得浓度为 10mg/L 的混合标准中间液。 样品前处理 准确称取粉碎后的饲料样品1.0g， 加7mL水浸泡，再加10mL乙腈和 1.0gNaCl， 振荡提取 3min，然后以10000rpm 的速度冷冻离心，离心后取上清液 2mL 加 C18吸附剂和无水硫酸镁各 100mg， 振荡后过 0.22um滤膜后上机分析。 实验条件 色谱柱： TG-5MS (30mx0.25 mmx0.25 um)； 柱温：50℃(1 min)， 20℃/min 到250℃(5min)； 进样模式：分流进样，分流比：20：1，进样量：：1pL； 进样口温度：250℃； 载气：高纯氮气(99.999%)，恒流模式，11.2mL/min： 检测器温度：250℃，氢气35mL/min， 空气350mL/min， 尾吹气氮气 40mL/min。 结果与讨论 色谱柱的选择：分别用极性不同的 TG-WAX (30 mx0.25 mmx0.25 um) 和 TG-5(30mx0.25 mmx0.25 um) 两根色谱柱对所测三种物质进行分离，结果表明 TG-WAX 柱对BHA和EQ的分离效果较差，不能达到基线分离，而 TG-5色谱柱对三种物质能够达到有效分离(见图1)。所以选用 TG-5色谱柱作为本实验中使用的色谱柱。 图1100mg/L标准溶液气相色谱图 提取溶剂的选择：分别用极性溶剂(乙腈)和非极性溶剂(正己烷)来提取饲料中的抗氧化剂，比较提取的效率。结果表明，乙腈对这三种抗氧化剂的提取效率要高于正己烷的提取，提取液进样用气相色谱仪分析(图2)，可看出，正己烷提取液含杂质也较多，对分析物的测定有一定干扰，而乙腈提取液相对洁净。因此在本实验中选取乙腈为提取溶剂。 净化方法的选择：按照标准方法中，提取液过弗罗里硅土柱净争，二氯甲烷-丙酮混合溶剂洗脱， BHT 回收率极低。考虑到乙腈提取液杂质并不多，因此放弃固相萃取小柱净化的方法，采用分散固相萃取的方法净化，向提取液中加入 C18吸附剂振荡除杂，操作简单，目标物无损失。 图2正己烷和乙腈萃取情况比较(上图为正己烷萃取液， 下图为乙腈萃取液)线性关系及测定低限：准确移取适量抗氧化剂混合标准中间液，分别用正己烷稀释配制得到浓度为0.1、0.5、1、2、5 mg/L的标准工作液，供气相色谱质谱测定。以测定峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线如图3。方法检出限以3倍信噪比计算得到，本方法测定饲料中的3种抗氧化剂的检出限为 1mg/kg. 图3三种抗氧化剂的线性情况 回收率及精密度实验：用标准添加法，在饲料样品中，添加抗氧化剂混合标准溶液，做加标回收实验，按上述方法进行提取、净化和测定，饲料样品添加浓度为 3mg/kg 和30mg/kg两个水平，各做3个平行，样品、添加谱图见图4，结果见表1。 78.00 8.509.00 9.50 10.0010.5011.0011.5012.00 图4样品空白和样品加标谱图(自上而下依次为样品加标、实际样品、标准溶液) 表1实际样品添加实验回收率和精密度 添加水平(mg/kg) 3.0 30.0 回收率(%) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) BHA 86.5 12.54 109.8 9.76 BHT 71.9 7.59 77.8 5.81 EQ 108.5 10.93 106.3 6.75 用该方法测定了三个实际样品中的 BHA， BHT， EQ的含量，对超出标准曲线范围的稀释后定量。结果见表2。 表2实际样品测定结果(mg/kg) 鸡饲料 猪前期饲料 猪浓缩饲料 BHA 1.126 ND ND BHT 45.97 ND ND EQ 515.4 71.17 20.63 结论 饲料中的抗氧化剂经乙腈提取，分散固相萃取的方法净化，采用赛默飞世尔新型气相色谱仪进行检测。结果表明该方法操作简单，提取效率高，回收率和重现性均能满足实验室日常检测的要求。 ( 参考文献 ) ( [1]商军，蔡金华，黄士新。高效液相色谱法同时测定饲料中四种抗氧化剂含量。上海市畜牧兽医学会2011年学术年会论文集。 ) ( [2]杨晓凤，凝胶渗透色谱净化-气相色谱法同时测定饲料中4种抗氧化剂，中国饲料，2011 (5) ： 38-44 ) 抗氧化剂即为防止或延缓饲料中某些活性成分发生氧化变质而添加于饲料中的制剂。主要用于含有高脂肪的饲料，以防止脂肪氧化酸败变质，也常用于含维生素的预混料中，它可防止维生素的氧化失效。我国《食品添加剂使用卫生标准》（GB2760―1996）中规定：丁基羟基茴香醚可用于食用油脂、油炸食品、干鱼制品、饼干、方便面、速煮米、果仁罐头、腌腊肉制品、早餐谷类食品，其最大使用量为 0.2g/kg。丁基羟基茴香醚与二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯混合使用时，其中丁基羟基茴香醚与二丁基羟基甲苯总量不得超过 0.1 g/kg，没食子酸丙酯不得超过0.05 g/kg（使用量均以脂肪计）。此外也可用于胶姆糖配料。饲料中的抗氧化剂经乙腈提取，分散固相萃取的方法净化，采用赛默飞世尔新型气相色谱仪进行检测。结果表明该方法操作简单，提取效率高，回收率和重现性均能满足实验室日常检测的要求。