血浆中5-氟尿嘧啶检测方案(液相色谱仪)

「应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 应用纪要 用于临床研究的血浆中5-氟尿嘧啶的分析方法 Stephen Balloch、Lisa Calton和Gareth Hammond 沃特世公司(英国威姆斯洛) 应用优势 简介 利用色谱和质谱检测提高分析的选择性 宽泛的动态范围(范围拓宽100倍) 样品制备过程简单、经济，仅使用极少的样品 5-氟尿嘧啶是一种抗肿瘤制剂，其通过干扰脱氧核糖核酸(DNA)合成以及小范围抑制核糖核酸(RNA)形成抑制肿瘤生长。由于5-氟尿嘧啶代谢的个体差异非常大，灵敏度和选择性俱佳的测定方法将有助于5-氟尿嘧啶的药代动力学和药效动力学临床研究。 分析速度快 本文将介绍一种临床研究方法，该方法在添加内标(5-氟尿嘧啶-13C15N，)之后，对血浆样品进行液液萃取。然后使用配备WatersTM ACQUITY UPLCTM HSSPFP色谱柱(2.1x100 mm， 1.8 um)的ACQUITY UPLC I-Class系统进行色谱分离，所需时间仅为3 min， 最后在XevoTM TQD质谱仪上进行检测(图1)。 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC I-Class系统 ACQUITY UPLC HSS PFP色谱柱主Xevo TQD MassLynx""软件TargetLynx"应用管理软件 图1. ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD联用系统。 ( 关键词 ) ( 5-氟尿嘧啶(5-FU)， UPLC-MS/MS ) 实验 样品制备：5-氟尿嘧啶认证参比标准品及其稳定标记内标(13C15N，)购自Toronto Research Chemicals(加拿大安大略省多伦多)。使用购自Golden West Biologicals(美国加利福尼亚州特曼库拉)的混合血浆作为替代基质制备校准品。5-氟尿嘧啶的标准曲线范围为20~2000 ng/mL。使用相同的混合血浆分别制备浓度为40、350、750和1500 ng/mL的QC样品。 样品萃取：向50pL样品中添加5 pL10 pg/mL溶于甲醇的内标(ISTD)，旋涡混合30s。加入500pL含0.1%甲酸(体积比)的乙酸乙酯溶液，旋涡混合30s， 然后以16，100g的离心力离心2 min。取400pL上清液在40℃下氮气吹干。用75 pL 0.1%甲酸水溶液复溶后，在UPLC-MS/MS上分析。 LC条件MS条件系统：ACQUITY UPLCI-Class (FTN)系统：Xevo TQD进样针：30 pL分辨率：MS1(0.7 FWHM) MS2 (0.7 FWHM)色谱柱：ACQUITY UPLC HSS PFP 色谱主采集模式：多重反应监测(MRM)流动相A：水(详见表2)流动相B：乙腈电离模式：ESI负离子模式洗针液：80%甲醇水溶液毛细管电压：3.0 kV+0.1%甲酸离子源温度：140°C灌注溶液：流动相A脱溶剂气温度：450°C密封清洗液20%甲醇水溶液驻留时间：0.05s(5-氟尿嘧啶)柱温：35°℃0.015s(内标)进样体积：20 pL扫描间延迟时间：0.02s流速：0.40 mL/min通道间延迟时间：0.01 s 梯度： 数据管理 时间(min) %流动相 %流动相 曲线 起始 98 2 起始 0.5 98 2 1 2.0 40 60 6 2.1 2 98 11 2.5 2 98 11 2.51 98 2 11 带TargetLynx应用管理软件的MassLynx软件4.1版 方法条件 表1.色谱洗脱时间表。 分析物 母离子 子离子 锥孔 电压 (v) 碰撞能量 (m/z) (m/z) (ev) 5-氟尿嘧啶(定量离子) 129.0 41.9 28 14 5-氟尿嘧啶 (定性离子) 129.0 86.0 28 16 5-氟尿嘧啶-13C15N，(内标) 132.0 43.9 28 14 运行时间： 3.0 min(进样间的间隔时间为3.5 min) 表2.本研究中所用的5-氟尿嘧啶及其内标(5-氟尿嘧啶-13C15N，)的MRM参数。 实验结果 在上述色谱条件下，5-氟尿嘧啶与血浆中萃取出的同分异构干扰物(大约在1.1 min处洗脱)实现了分离。5-氟尿嘧啶的保留时间约为1.18 min. 图2.5-FU (20ng/mL)和血浆空白样的示例色谱图。 在分析5-氟尿嘧啶浓度高达10，000 ng/mL的血浆样品之后，未观察到系统残留。分析灵敏度研究结果表明，该方法5-氟尿嘧啶的定量限为7.5 ng/mL(RSD<20%，偏差<15%)。 精度评估试验设计为五天内每天萃取并定量分析四个不同浓度的QC样品(每个浓度五个重复样， n=25)，通过分析各QC水平的五个重复样评估方法的重现性。表3显示了，四个浓度水平的5-氟尿嘧啶的总精度和重现性的RSD均小于9%。 浓度 总精度 重现性 (ng/mL) (%RSD) (% RSD) 40 9.0 7.2 350 5.4 4.4 750 7.3 6.3 1500 5.5 5.0 表3.5-氟尿嘧啶分析的总精度和重现性。 将高浓度和低浓度5-氟尿嘧啶混合样品按不同比例混合并进行分析，结果表明该方法在14~2600 ng/mL的范围内呈线性。 本研究评价了血浆中含有低浓度(40 ng/mL)和高浓度(1500 ng/mL)5-氟尿嘧啶时的基质效应(n=6)。低浓度下的基质效应因子为0.62~0.69(平均值0.66)，高浓度下的基质效应因子为0.46~0.75(平均为0.65)。使用同位素标记的5-氟尿嘧啶内标可补偿观察到的基质效应，得到低浓度和高浓度下的基质因子分别为0.94~0.98(平均值0.96)和0.96~1.05(平均值1.02)。 通过测定添加了高浓度的内源性化合物(白蛋白、胆红素、胆固醇、甘油三酸酯和尿酸)和外源性物质(20%脂肪乳剂)的混合血浆样品中5-氟尿嘧啶高/低加标(40 ng/mL和1500 ng/mL)的回收率(n=3)，评估了这些物质可能对分析造成的干扰。所得回收率范围为90.5%~10.6%。评估对乙酰氨基酚、氟康唑、5，6-二氢-5-氟尿嘧啶、酮康唑、伊曲康唑、甲氨蝶呤、苯妥英、泊沙康唑、尿嘧啶和伏立康唑对分析的干扰作用，得到回收率范围为91.8%~108.0%。导致回收率超出85%~115%范围的物质被视为干扰物。 结论 本研究为血浆5-氟尿嘧啶的分析开发了一种高灵敏度、高选择性的临床研究方法。 此分析方法的样品制备过程快速、经济，仅使用50pL样品即可使低浓度的(20 ng/mL)5-氟尿嘧啶达到足够的分析灵敏度，并表现出优异的精度。 实验证明该方法具有良好的线性，且未观察到系统残留污染。使用内标可充分补偿基质效应。 此方法对于5-氟尿嘧啶的药代动力学和药效动力学研究具有重要的应用价值。 仅供研究使用，不适用于诊断。 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters、The Science of What’s Possible、Xevo、MassLynx、ACQUITY UPLC和TargetLynx是沃特世公司的商标。其斤所有商标均归各自的拥有者所有。 ( 参考文献 ) ( 1. Fakih MG， Fetterly G ， Egorin MJ， Muindi JR， Espinoza-Delgado l， Zwiebel JA， Litwin A，H o lleran JL， Wang K and Diasio RB. A P h asel， Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Study of Two Schedules of Vorinostat in Combinationwith 5 -fluorouracil and Leucovorin in P atients with R efractory Solid Tumors. Clin C ancer Res.2010 Jul15；16(14)：3786-94. ) 扫一扫，关注沃特世微信 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-52093866 上海：021-6156 2666 广州：020-28296555 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400) 8202676Www.waters.com 用于临床研究的血浆中-氟尿嘧啶的分析方法 用于临床研究的血浆中-氟尿嘧啶的分析方法 简介5-氟尿嘧啶是一种抗肿瘤制剂，其通过干扰脱氧核糖核酸(DNA)合成以及小范 围抑制核糖核酸(RNA)形成抑制肿瘤生长。由于5-氟尿嘧啶代谢的个体差异非 常大1，灵敏度和选择性俱佳的测定方法将有助于5-氟尿嘧啶的药代动力学和 药效动力学临床研究。 本文将介绍一种临床研究方法，该方法在添加内标(5-氟尿嘧啶-13C15N2)之后， 对血浆样品进行液液萃取。然后使用配备WatersTM ACQUITY UPLCTM HSS PFP色谱柱(2.1 x 100 mm, 1.8 µm)的ACQUITY UPLC I-Class系统进行色谱分 离，所需时间仅为3 min，最后在XevoTM TQD质谱仪上进行检测。 结论1）本研究为血浆5-氟尿嘧啶的分析开发了一种高灵敏度、 高选择性的临床研究方法。2）此分析方法的样品制备过程快速、经济，仅使用50µL样品 即可使低浓度的(20 ng/mL)5-氟尿嘧啶达到足够的分析灵敏度， 并表现出优异的精度。3）实验证明该方法具有良好的线性，且未观察到系统残留污染。使用内标可充分补偿基质效应。 4）此方法对于5-氟尿嘧啶的药代动力学和药效动力学研究具有重要的应用价值。