人血浆中华法林检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-786Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-364 http：//www.shimadzu.com.cn咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996Building C801，No.180 Yizhou Road， Shanghai Nexera MX 平行液相色谱质联联用系统测定人血浆华法林浓度 LCMSMS-364 摘要：本文建立了一种使用岛津 Nexera MX 平行液相色谱仪和三重四极匹质谱仪 LCMS-8050 联用测定人血浆中华 法林的方法。该方法使用岛津 Nexera MX 平行液相三重四杆杆质谱联用系统在2 min 内完成分析，采用同位素内标华法林-d5定量，定量限为 4ng/mL， 依据临床血药浓度建立线性测定范围为 40-4000 ng/mL， 相关系数为0.9999。低、中、高各浓度水平样品的准确度在91.92-102.7%之间。使用该方法分析了临床口服华法林片剂患者的血液样品，具有分析速度快、灵敏度高、重现性好的特点，采用 Nexera MX 超高速 LCMS 分用分析系统显著缩短分析时间，是一种快速、准确和高通量的临床医学检验人血浆中华法林含量的的检测方法，适合临床医学检验分析。 关键词： LCMSMS华法林 Nexera MX 平行液相质谱系统 乳华法林钠 (warfarin sodium)作为一种双香豆素类抗凝药物，因其化学结构与维生素K的结构相似，可在体内通过维生素K依赖的多作用靶点来抑制凝血因子 lla、Vlla、IXa、Xa来发挥抗血栓作用。华法林是目前最为常用的口服抗凝药物，适用于预防和治疗血栓栓塞性疾病，药效慢而持久，对需长期维持抗凝者适合选用该药物。临床上用华法林防治血栓栓塞性疾病，可极大地降低栓塞的发病率和死亡率。但是，华法林使用过量会出现过度抗凝的情况，易造成出血倾向，因此临床对检测其血药浓度十分重视。并且华法林使用的个体差异大，不同的患者使用华法林的剂量不同。世界卫生组织建议用国际标准化比值(International Normalized Ratio INR) 作为抗凝监控指标，INR 需要保持在2.0-3.0之间。华法林的安全性和有效性需要密切监测，必要时调整华法林剂量，以达到一个精准化给药的治疗。目前，临床常用的监测方法有 HPLC 法、自动生化仪等方法，但这些方法存在灵敏度低，样品检测通量低等缺点。 本研究用 Nexera MX 平行液相色谱仪和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用系统分析了临床口服华法林片剂患者的血液样品，具有分析速度快、灵敏度高、重现性好的特点，采用 Nexera MX 超高速 LCMSMS 联用分析系统显著缩短分析时间，是一种快速、准确和高通量的临床医学检验人血浆中华法林含量的的检测方法，适合临床医学检验分析。 实验部分 1.1仪器 岛津超高效液相色谱仪LC-30A系统。具体配置为： LC-30AD×4输液泵， DGU-20Ag×2在线脱气机， SIL-30ACMP(自动进样器)， CTO-20AC 柱温箱， CBM-20A 系统控制器， LCMS-8050 三重四极杆质谱仪配ESI电离源，LabSolutions Ver.5.91 色谱工作站。 1.2分析条件 色谱条件：质谱条件：色谱柱： Shim-pack GIST (2.1 mmI.D.离子源： ESI，正离子模式×50 mm L， 2.0 um)雾化气流速：3.0 L/min流动相：A相/C相： (0.1%甲酸)水，干燥气流速：10 L/minB相/D相：甲醇驻留时间： 100 ms柱温：40℃接口温度：300℃梯度：采用梯度洗脱的方式，梯度程序见表2、MRM 参数：见表1表3和表4DL温度：250℃流速：0.4 mL/min接口电压：4.0kV进样体本：2pL 表1 MRM参数 No. 名称 英文名称 CASNo. 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3Pre Bias(V) 1 华法林 Warfarin 81-81-2 309.10* 163.05 -16.0 -14.0 -30.0 309.10 251.05 -15.0 -18.0 -17.0 华法林-d5 Warfarin-d5 75472-93-4 314.35* 256.10 -22.0 -19.0 -13.0 314.35 43.15 -12.0 -27.0 -30.0 *表示定量离子 1.3样品制备 华法林和华法林-d5(结构式见图1)标准溶液配制：使用甲醇溶液分别制备浓度为2 mg/mL 和1mg/mL的华法林和华法林-d5的储备溶液。加入适当体积甲醇稀释储备溶液，制备浓度为400、1200、2000、4000、12000、20000 和40000ng/mL的华法林标准工作溶液，华法林-d5使用甲醇稀释储备溶液至终浓度为 400 ng/mL备用。所有储备溶液储存在4℃，所有工作溶液在使用前均新鲜制备。 吸取90uL人血浆，分别加入10 uL华法林各浓度点标准工作曲线溶液，依次配制成浓度为40、120200、400、1200、2000和4000 ng/mL 的标准曲线，加入10 uL 华法林-d5内标工作溶液，涡旋混合后加入290 uL甲醇沉淀蛋白，样品涡旋5分钟后以13，000 g， 4℃离心10分钟，取上清液150 uL 进行 LC-MS/MS分析。 样品前处理方法：90uL口服华法林钠片剂患者血浆样品加入10 uL 甲醇和 10 uL 华法林-d5内标工作溶液，涡旋混合加入 290 uL甲醇沉淀蛋白，样品涡旋5分钟后以13，000g， 4℃离心10分钟，取上清液 150 uL进行LC-MS/MS分析。 D 图1华法林和华法林-d5的化学结构式 1.4 MX系统流路图及各流路梯度设置 图2MX系统流路图 表2分析流路梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 0.00 Pumps Pump B Conc. 70 0.50 Pumps Pump B Conc. 70 1.5 Pumps Pump B Conc. 100 2.00 Controller Stop 表3冲洗平衡流路梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 0.00 Pumps Pump B Conc. 100 0.50 Pumps Pump B Conc. 100 0.60 Pumps Pump B Conc. 70 2.00 Controller Stop 表4'常规液相梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 70 1.50 Pumps Pump B Conc. 100 2.50 Pumps Pump B Conc. 100 2.51 Pumps Pump B Conc. 70 4.00 Controller Stop 图31MX系统液相梯度曲线图 图4常规液相梯度曲线图 结果与讨论 2.1专属性考察 分别考察空白替代基质、空白替代基质加标和实测血浆样品，结果表明，替代基质对华法林及其内标华法林-d5的检测均无干扰(见图5)。 图5华法林及其内标华法林-d5专属性考察图 2.2标准曲线、检出限 (LLOD) 和定量限(LLOQ) 用血浆基质和标准工作液配制成 40、120、200、400、1200、2000和4000 ng/mL标准曲线样品，按照1.3中的样品前处理方法进行处理。分析测定后，按照 S/N>3为最低检测限，最低检测限为2 ng/mL；S/N>10为最低定量限，华法林的最低定量限为4ng/mL (见图5)。以浓度为横坐标，峰面积比为纵坐标，内标法制作标准曲线(图6)。在40-4000 ng/mL 浓度范围内线性良好，线性方程、线性范围和相关系数见表5. 图6华法林标准曲线图 表5各组分工作曲线及相关系数(1/c加权) No. 名称 线性范围(ng/mL) 线性方程 相关系数r 准确度(%) 华法林 40-4000 Y=0.1538X-0.0146 0.9999 88.50-114.8 2.3测定重复性 用血浆基质配制低、中、高三个浓度的质控样品，得浓度为低 (120 ng/mL)、中(400 ng/mL) 和高(1200ng/mL)的样品，按照1.3中的样品前处理方法进行处理，连续进样12次， 计算 Stream1(6次) 和 Stream2 (6次)双流路分析样品时保留时间和峰面积的重现性。结果(表6)表明：保留时间的 RSD 值小于0.23%，峰面积比的 RSD 值小于3.18%。 表6 Nexera MX双流路系统测定华法去精密度 (n=12) 针次 120 ng/mL 400 ng/mL 1200 ng/mL 保留时间 面积比 保留时间 面积比 保留时间 面积比 (min) (min) (min) 1 1.045 4.75 1.045 16.59 1.044 51.24 2 1.049 4.73 1.048 15.02 1.049 48.69 3 1.045 4.84 1.044 15.83 1.044 48.95 4 1.049 4.68 1.047 15.42 1.048 47.11 5 1.045 4.75 1.044 15.46 1.045 48.08 6 1.047 4.55 1.048 15.43 1.048 47.53 7 1.045 4.88 1.044 14.85 1.044 48.31 8 1.043 4.59 1.049 14.69 1.047 47.48 9 1.045 4.76 1.044 15.56 1.044 46.70 10 1.047 4.74 1.048 15.57 1.049 48.68 11 1.044 4.70 1.044 15.50 1.044 47.79 12 1.047 4.78 1.050 15.23 1.050 47.05 RSD (%) 0.18 1.97 0.22 3.18 0.23 2.52 2.4质控样品准确度考察 用血浆基质和标准工作液配制低(120ng/mL)、中 (400ng/mL)和高(1200ng/mL)三个浓度的质控样品，按照1.3中的样品前处理方法进行处理。连续进样6次，计算低、中、高不同浓度 Nexera MX 平行液质联用系统测定的准确度(表7) 表7 华法林在Nexera MX双流路系统的准确度考察(n=6) 配制浓度 测定浓度 准确度 (ng/mL) (min) 面积比 (ng/mL) (%) 1.045 4.35 110.3 91.92 1.047 4.44 114.8 95.67 120 1.046 4.37 110.4 92.01 1.050 4.25 113.6 94.64 1.045 4.42 115.3 96.11 1.054 4.24 113.2 94.34 1.045 14.95 378.0 94.50 1.048 14.53 372.7 93.17 400 1.045 14.38 375.0 93.76 1.049 14.42 373.9 93.48 1.045 14.33 377.7 94.42 1.049 14.54 388.8 97.21 1.045 46.89 1180.5 98.37 1.049 46.69 1197.3 99.78 1200 1.045 47.40 1227.5 102.3 1.049 47.21 1232.7 102.7 1.046 46.04 1214.2 101.1 1.049 45.40 1219.2 101.6 2.5提取回收率和基质效应 考察待测组分在不同浓度下基质效应的影响，以及该条件下的血浆提取回收率。配制待测组分的标准添加血浆样品，按照样品前处理操作后测定响应值(C组)；将空白血浆蛋白沉淀后标准添加待测组分测定响应值(B组)；用流动相配制相应浓度不含基质的纯样品溶液测定响应值(A组)。绝对基质效应的计算值为B组样品与A组样品的色谱峰面积比；提取回收率的计算值为C组样品与B组样品的色谱峰面积比。结果(表8)显示：华法林的基质效应在98.74-102.03%之间，提取回收率在97.98-99.82%。 表8华法林在血浆样品中的基质效应和提取回收率考察(n=6) 浓度 (ng/mL) 基质效应(%) 提取回收率(%) 平均值 RSD(%) 平均值 (%) RSD(%) 1200 98.74 1.63 98.61 2.96 400 101.39 2.13 99.82 1.61 120 102.03 2.15 97.98 1.06 2.6 残留实验 在高浓度样品(1200 ng/mL) 分析结束后进样空白样品，考察华法林和华法林-d5的残留。结果如图7所示：高浓度样品进样分析后华法林和华法林-d5无残留。 图7华法林和华法林-d5残留考察色谱图 2.7实测9名患者血液样品 收集口服华法林钠片剂患者的血浆样品，使用岛津 Nexera MX 平行液相色谱仪和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050联用测定人血浆中华法林的浓度，使用实测样本考察 MX 系统检测的重复性和灵敏度，结果见表9。 表9 Nexera MX双流路系统测定患者血浆浓度 1.044 20.45 531.9 Sample-005 1.048 20.89 543.1 544.1±8.4 1.044 20.83 541.8 1.044 20.78 540.3 1.045 21.33 554.6 1.042 21.25 552.6 1.044 51.00 1326.3 1.043 46.48 1208.6 Sample-006 1.044 50.34 1309.0 320.0±10.2 1.047 49.38 1284.2 1.044 48.63 1264.5 1.043 49.35 1283.2 1.043 50.13 1303.5 1.042 46.68 1213.9 Sample 007 1.043 47.83 1243.9 1225.3±3.0 1.043 46.45 1208.0 1.043 45.61 1186.0 1.048 46.02 1196.8 1.044 30.71 798.6 1.038 30.15 783.9 Sample-008 1.044 31.41 816.9 800.7±13.7 1.048 31.00 806.2 1.043 31.25 812.6 1.047 30.22 785.8 1.044 32.62 848.3 1.044 33.74 877.3 Sample-009 1.044 33.58 873.1 868.8±15.1 1.048 33.68 875.9 1.044 32.77 852.1 1.045 34.07 886.0 2.8 Nexera MX 效率及性价比 应用 Nexera MX 系统完成一个人血浆样本中华法林含量测定用时2 min， 而常规 LCMS分析方法用时 4 min。以100个样本为例，使用 Nexera MX 系统测定仅需用时200 min， 而常规 LCMS 测定需要400 min， 因此 NexeraMX系统可以将常规LCMS 分析时间缩短一半。在性价比方面，在常规 LCMS系统上增加两台 LC-30AD 输液泵及流路切换阀即可升级为 Nexera MX系统，在批量分析大量样本时，硬件成本及 Nexera MX系统的分析效率是一个优质的选择。 结论 本文建立了一种使用岛津 Nexera MX 平行液相色谱仪和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用测定人血浆中华法林的方法。该方法使用岛津 Nexera MX 平行液相三重四极杆质谱联用系统在2 min 内完成分析，采用同位素内标华法林-d5定量，定量限为4ng/mL，依据临床血药浓度建立线性测定范围为 40-4000ng/mL， 相关系数0.9999。低、中、高各浓度水平样品的准确度在91.92-102.7% 之间。该方法分析了临床口服华法林片剂患者的血液样品，使用双流路分析检测样品，充分利用了系统冲洗、色谱柱平衡的时间，具有分析速度快、灵敏度高、重现性好的特点。采用 Nexera MX 超高速 LCMS系用分析系统显著缩短分析时间，将常规液相4 min 才能够完成的梯度洗脱程序缩短为2 min， 血液样品的分析通量提高至原来的2倍，与常规 LCMS 方法相比较，是一种快速、准确和高通量的临床医学检验人血浆中华法林含量的的检测方法，适合临床医学检验分析。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 本文建立了一种使用岛津Nexera MX平行液相色谱仪和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用测定人血浆中华法林的方法。该方法使用岛津Nexera MX 平行液相三重四极杆质谱联用系统在2 min内完成分析，采用同位素内标华法林-d5定量，定量限为4 ng/mL，依据临床血药浓度建立线性测定范围为40-4000 ng/mL，相关系数为0.9999。低、中、高各浓度水平样品的准确度在91.92-102.7%之间。使用该方法分析了临床口服华法林片剂患者的血液样品，具有分析速度快、灵敏度高、重现性好的特点，采用Nexera MX超高速LCMS联用分析系统显著缩短分析时间，是一种快速、准确和高通量的临床医学检验人血浆中华法林含量的的检测方法，适合临床医学检验分析。