人血浆中华法林检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-785Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-363 http：//www.shimadzu.com.cn咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996Building C801， No.180 Yizhou Road， Shanghai LCMS-8050 液相质谱联用测定人血浆华法林浓度 LCMSMS-363 摘要：本文建立了一种使用岛津LCMS-8050 液相质谱联用测定人血浆华法林的方法。该方法使用岛津 LCMS-8050三重四极杆质谱在3 min 内完成分析，采用同位素华法林-d5 为内标定量，定量限为4ng/mL， 依据临床血药浓度建立线性测定范围为40-4000 ng/mL， 相关系数0.9995， 各浓度水平样品的准确度在90.8-111.1%之间。使用该方法分析了临床口服华法林制剂患者的血液样品，具有分析速度快、灵敏度高和重现性好的特点，采用LCMS-8050 液相质谱联用仪可以作为临床治疗药物监测人血浆华法林的一种方法。 华法林木(warfarin) 是目前临床使用最为广泛的香豆素类抗凝药物，在体内通过维生素K依赖的多作用靶点来抑制凝血因子 lla、Vlla、IXa、Xa 发挥抗血栓作用。临床上用于防治血栓栓塞性疾病，可极大地降低栓塞的发病率和死亡率。但是，华法林使用过量会出现过度抗凝的情况，易造成出血倾向。华法林的剂量受性别、年龄、体重、饮食、基因多态性等因素的影响，使得临床疗效个体差异很大，不同的患者需要华法林的剂量不同。世界卫生组织建议用国际标准化比值(InternationalNormalized Ratio， INR) 作为抗凝监控指标， INR需要 保持在2.0-3.0之间。华法林的安全性和有效性需要密切监测，必要时调整华法林剂量，以达到一个精准化给药的目的。 目前，临床常用的监测方法有 HPLC 法、自动生化仪等方法，但这些方法存在灵敏度低，样品检测通量低等缺点。本研究用 LCMS-8050三重四极杆质谱仪分析临床口服华法林片剂患者的血液样品，具有分析速度度、灵敏度高、重现性好的特点，采用LCMS-8050 液相质谱联用仪可以作为临床治疗药物监测人血浆华法林的一种方法。 实验部分 1.1仪器 岛津高效液相色谱仪 LC-30A 系统。具体配置为： LC-30AD×2输液泵， DGU-20A5R在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-20AC 型柱温箱， CBM-20A系统控制器， LCMS-8050三重四极杆质谱仪配ESI电离源， LabSolutionsVer5.91 色谱工作站。 1.2分析条件 质谱条件：色谱柱： Shim-pack GIST (2.1 mm I.D.离子源：ESI，正离子模式×50 mmL，2.0 um)雾化气流速：3.0 L/min流动相：A相：(0.1%甲酸)水，B相：甲醇干燥气流速： 10 L/min柱温：40℃驻留时间：100ms梯度：采用梯度洗脱的方式，梯度程序见表2接口温度：300℃流速： 0.4mL/minMRM 参数：见表1进样体积：2uLDL温度：250℃接口电压：4.0kV 表1 MRM参数 No. 名称 英文名称 CASNo. 前体离子 产物离子 Q1PreBias(V) CE(V) Q3 PreBias(V) 1 华法林 Warfarin 81-81-2 309.10* 163.05 -16.0 -14.0 -30.0 309.10 251.05 -15.0 -18.0 -17.0 2 华法林-d5 Warfarin-d5 75472-93-4 314.35* 256.10 -22.0 -19.0 -13.0 314.35 43.15 -12.0 -27.0 -30.0 *表示定量离子 表2液相梯度洗脱程序表 Time(min) Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 60 2.50 Pumps Pump B Conc. 90 2.51 Pumps Pump B Conc. 60 3.00 Controller Stop 1.3血浆样品制备 华法林和华法林-d5(结构式见图1)标准溶液配制：使用甲醇溶液分别制备浓度为 2 mg/mL 和1mg/mL的华法林和华法林-d5的储备溶液。加入适当体积甲醇稀释储备溶液，制备浓度为400、1200、2000、4000、12000、20000和 40000 ng/mL的华法林标准工作溶液，华法林-d5使用甲醇稀释储备溶液至终浓度为 200 ng/mL 备用。所有储存溶液储存在4℃，所有工作溶液在使用前均新鲜制备。 吸取90 uL人血浆，分别加入10 uL 华法林各浓度点标准工作曲线溶液，依次配制成浓度为40、120、200、400、1200、2000和4000 ng/mL标准曲线样品，加入10 uL华法林-d5内标工作溶液，涡旋混合后加入290 uL 甲醇沉淀蛋白，样品涡旋5分钟后以 13，000 g， 4℃离心10分钟，取上清液150 uL 进行 LC-MS/MS 分析。 样品前处理方法：90uL口服华法林钠片剂患者血浆样品加入10 uL甲醇和 10 uL华法林-d5内标工作溶液，涡旋混合加入290 uL甲醇沉淀蛋白，样品涡旋5分钟后以13，000 g，4℃离心10分钟， 取上清液150 uL 进行 LC-MS/MS分析。 图1华法林和华法林-d5的化学结构式 结果与讨论 2.1专属性考察 分别考察空白血浆、空白血浆加标和实测血浆样品，按照1.3项样品处理方法处理血浆，结果如图2所示。结果表明，血浆基质对华法林及其内标华法林-d5的检测均无干扰。 空白血浆处理色谱图 空白血浆处理色谱图 图2华法林及内标华法林-d5专属性考察图 2.2标准曲线、检出限(LLOD) 和定量限 (LLOQ) 用血浆基质和标准工作液配制成40、120、200、400、1200、2000和4000 ng/mL标准曲线样品，按照1.3中的样品前处理方法进行处理。分析测定后，按照 S/N>3为最低检测限，华法林最低检测限为2ng/mL； S/N>10为最低定量限，华法林的最低定量限为4 ng/mL (见图2)。以浓度为横坐标，峰面积比为纵坐标，内标法制作标准曲线(图3)。结果显示华法林在 40-4000 ng/mL浓度范围内线性良好，线性方程为Y=0.8438X+0.5567(1/c加权)，相关系数为 0.9995，准确度范围为90.80-111.1%。 图3华法林标准曲线图 2.3测定重复性 用血浆基质和标准工作液配制低(120ng/mL)、中(400ng/mL) 和高(1200ng/mL) 三个浓度的质控样品，按照1.3中的样品前处理方法进行处理。连续进样6次，计算样品分析的保留时间和峰面积的重现性。结果(表3)表明：保留时间的 RSD 值小于0.14%，峰面积比的 RSD 值小于1.75%。 表3 LCMS-8050测定华法林精密度(n=6) 120 400 1200 浓度 保留时间 面积比 准确度 保留时间 面积比 准确度 保留时间 面积比 准确度 (ng/mL) (min) (%) (min) (%) (min) (%) 1.336 10.32 97.1 1.339 34.24 96.49 1.339 99.51 94.25 1.335 10.97 103.5 1.337 34.16 96.26 1.337 97.55 92.29 1.335 11.80 111.5 1.341 33.96 95.69 1.337 95.70 91.41 1.337 11.77 111.2 1.340 34.48 97.17 1.337 97.62 91.93 1.339 11.59 109.5 1.339 33.71 94.98 1.336 95.01 91.03 1.340 11.44 108.0 1.338 34.57 97.91 1.335 95.62 91.18 RSD(C(%) 0.157 4.760 4.919 0.106 0.947 0.938 0.099 1.752 1.749 2.4提取回收率和基质效应 考察待测组分在不同浓度下基质效应的影响，以及该条件下的血浆提取回收率。配制待测组分的标准添加血浆样品，按照样品前处理操作后测定响应值(C组)；将空白血浆蛋白沉淀后标准添加待测组分测定响应值(B组)；用流动相配制相应浓度不含基质的纯样品溶液测定响应值(A组)。绝对基质效应的计算值为B组样品与A组样品的色谱峰面积比；提取回收率的计算值为C组样品与B组样品的色谱峰面积比。结果显示(表4)：华法林的基质效应在100.9-105.9%之间，提取回收率在103.8-112.3%。 表4华法林在血浆样品中的基质效应和提取回收率考察(n=6) 浓度(ng/mL) 基质效应(%) 提取回收率(%) 平均值 RSD((%) 平均值 RSD9(%) 1200 100.9 5.48 105.1 0.68 400 105.9 3.75 103.8 3.72 120 101.1 4.83 112.3 4.28 2.5残留实验 由在高浓度样品(1200ng/mL)分析束束后进样空白羊品，考察华法林和华法林-d5的残留。结果如图4所示。结果表明，高浓度样品进样分析后华法林和华法林-d5无残留。 图4华法林和华法林-d5残留考察色谱图 2.6实测6名患者血液样品 收集口服华法林钠片剂患者的血浆样品，按照1.3中的样品前处理方法进行处理。使用岛津 LCMS-8050 液相色谱质谱仪测定，考察该方法测定人血浆华法林浓度的重复性、灵敏度和准确性，结果见表5。 表5 LCMS-8050液相色谱质谱联用系统测定患者血浆华法林浓度 样品 保留时间 面积比 测定浓度 (Mean±SD) (min) (min) (ng/mL) 1.333 24.68 277.9 Sample-001 1.329 24.74 279.1 284.2±10.0 1.326 26.23 295.7 1.328 27.48 309.8 307.8±10.2 901.0±33.2 Sample-002 1.327 26.30 296.7 1.326 28.08 316.7 1.333 79.22 894.1 Sample-003 1.332 77.13 871.8 1.330 83.77 937.2 909.5±13.5 1.330 82.09 925.1 Sample-004 1.333 79.90 901.3 1.333 79.99 902.2 1.331 72.07 814.8 821.2±16.7 Sample-005 1.334 74.62 840.2 1.332 71.76 808.6 Sample-006 1.333 72.74 816.9 820.3±3.1 1.336 72.77 822.9 1.335 72.62 821.1 结论 人血浆华法林样样经过蛋白沉淀处理后，使用岛津 LCMS-8050 液相质谱联用仪可准确测定。该方法使用岛津LCMS-8050 三重四极杆质谱在 3 min 内完成分析，采用同位素华法林-d5为内标定量，定量限为4 ng/mL， 依据临床血药浓度建立线性测定范围为40-4000 ng/mL， 相关系数0.9995，各浓度水平样品的准确度在90.8-111.1%之间。使用该方法分析了临床口服华法林制剂患者的血液样品，具有分析速度快、灵敏度高和重现性好的特点，采用LCMS-8050 液相质谱联用仪可以作为临床治疗药物监测人血浆华法林的一种方法。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 本文建立了一种使用岛津LCMS-8050液相质谱联用测定人血浆华法林的方法。该方法使用岛津LCMS-8050三重四极杆质谱在3 min内完成分析，采用同位素华法林-d5为内标定量，定量限为4 ng/mL，依据临床血药浓度建立线性测定范围为40-4000 ng/mL，相关系数0.9995，各浓度水平样品的准确度在90.8-111.1%之间。使用该方法分析了临床口服华法林制剂患者的血液样品，具有分析速度快、灵敏度高和重现性好的特点，采用LCMS-8050液相质谱联用仪可以作为临床治疗药物监测人血浆华法林的一种方法。