蛋白治疗药物中高通量、高分辨表征检测方案(液相色谱仪)

Waters使用新型反相色谱柱对蛋白治疗药物进行高通量、高分辨表征THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE.Jennifer Nguyen、Susan Rzewuski、Dan Walsh、Jim Cook、 Maureen DeLoffi、Gary Izzo、Yuehong Xu、Matthew A. Lauber沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德)此外，在使用UV进行检测时，相较于其它色谱其， BioResolve RP色谱柱的聚苯键合相没有可检出的残留(图7)，而且选择性优于典型的烷基键合相(图8)。如需下载此海报副本，请访问 WWW.WATERS.COM/POSTERSQ2018年沃特世公司 由于具有卓越的分离能力且兼容质谱(MS)检测，反相液相色谱(RPLC)常被用于蛋白治疗药物的表征分析。然而，众所周知反 相的性能有一定局限性，它们极其依赖离子对试剂，而且需要较高的分离温度，可能导致柱上蛋白质降解。为突破这些限制，沃特世开发了这款新型色谱柱。该色谱柱基于经过优化的2.7 pm实心核颗粒，旨在最大程度减小颗粒内的扩散，并提升色谱分离的动力学效率，而精心选定的450A最佳孔径则使其适用于完整单克隆抗体分析。此外，得益于新型表面材料，这款色谱柱的性能得到了进一步提升，这种表面材料是通过多步硅烷化工艺合成的苯基键合相，不仅覆盖率高，而且具有刚性保留结构。根据我们的研究，这种键合相可以大范围地掩蔽硅胶颗粒表面，从而限制硅醇基相互作用，这能最大程度减小蛋白质吸附，使得分析物在较低温度下也能实现更离散的解吸，此外，它还能增强固定相的保留性，进而提升色谱柱的分离能力。总之，该技术可提供无可比拟的分离度、更高的精度以及更高质量的数据，协助分析人员更好地表征mAb和 ADC治疗药物。 ( 图1. BioResolv e RP， 4 5 0 A， 2. 7p u m 固定相的 结构示意 图 ) 方法 除van Deemter和SEC分析外，所有实验均采用经过还原的IdeS酶解NIST抗体，即沃特世抗体亚基标准品(部件号186008927)。 心原完整mAb样品采用沃特世完整单抗质量数检查标准品(部件部1860__......06552)。英夫利昔单抗亚基样品在沃特世公司内部制备。使用0.1%三氟乙酸(TFA)或甲酸(FA)水溶液和0.1%TFA或FA的乙腈溶液运行样品分析(除非另有说明)。所用梯度为流动相B在20min内从5%升至55%，流速为0.2mL/min(用于2.1×50mm色谱柱)，并根据流速和/或色谱柱规格改变梯度时间。使用BioResolveRP色谱柱以及规格为2.1×50mm和2.1×150mm(除非另有说明其)的巾其它售市 售 色 谱 柱 ， 在 8 0 ℃下进行 1J分离上样量为1pg。上述 分析采用配备沃特世可变波长紫外(TUV)检测器的Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio系充， 在214nm或280nm下进行检，测，并使用MassLynx 4.1和UNIFI 1.8作为控制软件。 进行van Deemter分析时，在沃特世公司内部配制0.1mg/mL的碳酸酐酶。在0.05-1.2mL/min的范围内改变流速(增量为0.05mL/min)， 同时针对不同色谱柱调节乙腈比例，得到2.9~4.0之间的k'值。 ( 使用ACQUITY UPLC BEH SEC 450 A ， 2.5pm， 4.6×150mm色谱柱进行SEC分析. ) 根据《BioResolve RP色谱柱维护和使用手册》(720006027EN)中的说明，使用完整单抗质量数检查标准品对所有色谱柱进行活化具体方法条件(例如van Deemter和SEC分析的条件)请参阅沃特世应用纪要720006168EN和720006169EN。 图2.使用碳酸酐酶得到的市售色谱柱的van Deemter曲线比较 填充经过优化的2.7 pm实心核颗粒的BioResolve RP色谱柱表现出卓越的动力学性能，优于其它所有市售色谱柱经过优化的孔径 图3.使用平均孔径不同的色谱柱分离不同mAb组分的有效峰容量。上面一行图表是使用含FA的流动相分离以下物质的结果：A)沃特世抗体亚基标准品；B)英夫利昔单抗的F(ab')2亚基；C)沃特世完整单抗质量数检查标准品。下面一行图表是使用含TFA的流动相分离以下物质的结果：D)沃特世抗体亚基标准品；E)英夫利昔单抗的F(ab')2亚基；F)沃特世完整单抗质量数检查标准品。 0.12 oC 0.09 0.06 0.03 图4.采用原始条件以及80℃的反相条件(以甲酸(FA)或三氟乙酸(TFA)的30%乙腈(ACN)溶液为流动相)分离完整单抗质量数检查标准品得到的体积排阻色谱图。 3.0 4.0 506.07.08.09.0 10.011.0 12.0 当孔径从约300A增加至440A时， 使用含FA的流动相分离大分子IgG获得了更高的峰容量。在反相色谱所用的极端pH条件下，蛋白质会发生构象变化，如图4中的SEC色谱图所示。使用较弱的离子对试剂(如FA)时，蛋白质具有更大的构象半径，这会导致其扩散受限，进而影响分离。因此，为了获得最佳性能，我们为BioResolve RP色谱柱设计的孔径为450A。 图5.A)使用不同色谱柱和添加0.1%TFA作为改性剂的流动相分离不同mAb组分得到的色谱图和平均有效峰容量(n=2)。B)使用规格同为2.1×50mm的多款色谱柱分离NISTmAb亚基、英夫利昔、央天沐首单抗的F(ab')2亚基和沃特世完整单抗质量数检查标准品得到的有效峰容量，所用色谱条件均为柱效 温 娃80℃、流速0.2mL/min、载样量1pg，使用添加TFA的流动相。 图6.A)使用不同色谱柱和添加0.1%FA作为改性剂的流动相分离不同mAb组分得到的色谱图和平均有效峰容量(n=2)。B)使用添加FA的流动相分离NISTmAb亚基、英夫利昔单抗的F(ab)2亚基和沃特世完整单抗质量数检查标准品得到的有效峰容量。Lo 无论是使用含TFA(图5)还是含FA(图6)的流动相， BioResolve RP色谱柱在分离所有分析物时都表现出最高的分离能力。 残留极低 选择性优势 间[min] 图7.不同市售色谱柱的残留特性。(A)使用添加甲酸(FA)改性剂的流动相，在初始梯度条件下采集到的沃特世完整单抗质量数检查标准品色谱峰；(B)重复运行梯度得到的残留峰。 图8.由经过聚苯键合技术修饰的BioResolve RP颗粒组成的固定相与C键合相之间的选择性差异。 对温度和离子对试剂的依赖性更低 图9.使用五种不同的色谱柱，分别在(A) 0.1% FA、 (B) 0.02% TFA/0.08%FA和(C) 0.1% TFA (v/v)流动相条件下分离NISTmAb亚基(上图)和沃特世完整单抗质量数检查标准品(下图)得到的峰面积-柱温曲线。 .图9以峰面积来衡量mAb亚基和完整mAb的回收率，结果表明，在所有三种离子对试剂条件下以及整个温度范围内， BioResolve RP色谱柱的回收率均优于该实验中的其它色谱柱。此外，在以上所有条件下， BioResolve RP色谱柱均获得了最高的有效峰容量(具体数据未展示)。 示例：高通量，低TFA浓度和低温条件 图10.使用2.1×150 mm Bio-Resolve RP， 450 A，2.7 pm体谱柱分离抗体亚基标准品得到的色谱图，由图可见温度和TFA浓度对分离的影响。 图10表明，采用较低的温度和较低的离子对添加剂浓度也能实现高分离度的亚基分离。在65℃/0.05%TFA条件下分离得到的低丰度降解物峰明显更小， 表明BioResolve RP色谱柱有助于防止强酸和/或高温条件下可能产生的降解效应。 结论 ( 沃特世开发了一款基于2.7 pm实心核颗粒和独特聚苯键合相的新型色谱柱，可改善mAb及其亚基的反相分析 。 该色谱柱的基质 颗粒经过精心优化，可最大限度提高传质速率和避免扩散受阻，因此相较于常规反相固定相具有更优异的动力学特性。其独特的高覆盖率聚苯键合相不仅选择性优于其它固定相，而且在采用各种温度和离子对试剂的条件下均能提高峰容量并降低残留。综上所述， BioResolve RP色谱柱可协助色谱工作者提高分析通量和改善分离度，还有助于他们探索温度更低、MS兼容性更好 ) 的色谱条件。 沃特世开发了一款基于2.7 m实心核颗粒和独特聚苯键合相的新型色谱柱，可改善mAb及其亚基的反相分析。该色谱柱的基质颗粒经过精心优化，可最大限度提高传质速率和避免扩散受阻，因此相较于常规反相固定相具有更优异的动力学特性。