单抗聚集体和片段SEC分析中LC系统扩散检测方案(液相色谱仪)

[应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. [应用纪要 LC系统扩散对单抗聚集体和片段SEC分析的影响：基于方法选择最佳色谱柱规格 应用优势 教学式系统展示LC系统扩散对mAb的SEC分离的影响 指导用户根据所使用的LC系统和分析方法要求(包括分离度、灵敏度、重现性和可转换性)选择最佳的SEC色谱柱配置 展示ACQUITYMUPLC"H-Class Bio和ACQUITY Arc"Bio系统的SEC分离性能 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC H-Class Bio系统 ACQUITY Arc Bio系统 ACQUITY UPLC BEH SEC蛋白分析专用柱， 200A， 1.7 um XBridge"BEH SEC蛋白分析专用柱，业200A，3.5 um 关键词 体积排阻、系统扩散、UPLC、UHPLC、HPLC、蛋白质、IgG、英夫利昔单抗(Remicade) 过去，体积排阻色谱(SEC)是评估重组蛋白生物治疗药物中非共价蛋白质聚集体(高分子量物质[HMWS])时应用最广泛的方法。但近年来，由于SEC色谱柱和LC系统的性能提升，使用SEC对这些样品中的蛋白蛋片段(低分子量物质[LMWS])在非变性的条件下进行分析的方法也越来越受到人们的关注。其中最受关注的，是针对铰链区水解降解所产生IgG单克隆抗体(mAb)片段的分析方法。相较于将单体(约150 KDa)与二聚体和更高分子量形式HMWS(≥300KDa)分离的传统分离方法，LMWS片段(分子量为mAb单体分子量三分之二(约100KDa)的mAb主要形式)的分离可能更具挑战性。这是由于LMWS与单体的大小(流体动力学半径)相比于单体与HMWS蛋白质的大小更加接近。由于蛋白质洗 脱顺序中低浓度LMWS峰作为主(单体)峰上的拖尾肩峰洗脱，使分离难度进一 步增加。 虽然使用粒径为亚2 pm的SEC色谱柱能够提高效率，从而提高HMWS和LMWS的分析通量，但由于色谱柱硬件和填料的限制，这些高柱效SEC颗粒仅适用于内径为4.6mm或更小的色谱谱。使用HPLC色谱系统时，通常因为SEC粒径为3 pm及以上，可以选择7.8mm内径的色谱柱。虽然许多HPLC系统也能够在这些内径为4.6mm的SEC色谱柱所需流速和背压下运行，但存在一个经常被忽视的事实，即典型HPLC配置的柱外扩散相对大于这些UPLCSEC色谱柱所产生的峰体积，导致观察到的峰分离度明显降低。柱外扩散可以看作是样品在通过不含色谱柱的LC系统流路时发生的体积增加现象。 本研究的目的是系统性评估SEC粒径、色谱柱柱长和内径以及LC系统柱外扩散对mAb的HMWS和LMWS的分离度的影响，文中所述基本原理适用于其它蛋白质的SEC分析。此外，还将演示系统扩散对LMWS的检测下限和定量结果可靠性的不良影响。综上，提供与Waters""LC仪器兼容的色谱柱的选择建议。 实验 样品描述 使用过期的mAb样品英夫利昔单抗(Remicade)和曲妥珠单抗(赫赛汀°)，用去离子水将浓度稀释至2.0 mg/mL。 方法条件(除非另有说明) 流速和进样体积(除非另有说明)： LC条件 色谱柱规格 进样体积 系统： ACQUITY UPLC H-Class Bio (内径(mm)×柱长(mm)) 流速(mL/min) (uL) (除非另有说明) 4.6×150 0.350 1.0 4.6×300 0.350 2.0 样品温度： 10°C 测定系统扩散 色谱分析的一条基本原理是：色谱柱以外发生的柱外扩散或柱外色谱峰/谱带展宽始终会对分离度造成不良影响。在许多蛋白质和肽的梯度分离(例如反相和离子交换)中，分析物在上样条件下与固定相强力结合，并在柱床的头部重新浓缩，然后开始梯度洗脱。这些梯度分离方法，能够最大程度削弱甚至消除柱前谱带扩散造成的不良影响，使分析人员的主要关注点转向峰从色谱柱洗脱后发生的扩散。与此相反，在理想的SEC分离中，蛋白质样品和SEC颗粒表面不发生结合。对于SEC分离的实际情况是，柱前扩散与柱后扩散一样会降低分离质量。因此，评估样品在通过不含色谱柱的LC系统后体积和曲线的变化可能十分有用。 柱外扩散(系统谱带展宽)的测定已得到广泛研究。 感兴趣的读者可以参阅本应用纪要的姊妹篇《评估LC系统扩散对体积排阻色谱分析蛋白的影响》(沃特世应用纪要，部件号：720006337ZH)，其中更全面地讨论了系统扩散及其测定，并额外展示了有关柱外扩散对SEC分离影响的实验。本文测定了5o扩散体积(根据4.4%峰高处峰宽)，如图1所示。从图2所示扩散曲线可见，柱外扩散峰不对称(曲线存在明显的拖尾或偏斜)，因此峰宽测定位置越接近基线，受峰拖尾的影响可能就越大。因此，选择使用4.4%峰高处峰宽来测定5o峰值虽然有些武断，但这是大多数常用色谱数据系统(例如Waters Empower 3和Agilent ChemStation)所提供的峰高最低百分比处的峰宽。通过在色谱柱入口侧增加样品定量环， ACQUITY UPLC H-Class Bio系统上发生的各种柱外扩散情况如图2所示。 图1.使用3：7的水：乙腈作为流动相，在流速为0.3mL/min的条件下测定柱外扩散。样品为1 pL 0.16 mg/mL咖啡因(溶于1：9的水：乙腈)。以40Hz的采集速率监测273nm处的UV吸光度。 9.5pL(无定量环) 14.1pL(5pL定量环) 22.0pL(10pL定量环) 30.1pL(20pL定量环)42.3 L(10 pL+20pL定量环) 56.7 L(2×10 pL+2×20pL定量环) 图2.本研究根据4.4%峰高处峰宽测定的5-sigma柱外扩散体积(5o).实验按图1标题所述方法进行。将样品定量环连接在柱前以增加扩散体积。 系统扩散对生物治疗性单抗 HMWS和LMWS分离和定量的影响 图3所示为分离良好的英夫利昔单抗SEC色谱图，英夫利昔单抗是一种生物治疗性嵌合人-小鼠IgG单克隆抗体。分析过期样品，其中HMWS(假设主要为二聚体(约300 KDa)形式)以约0.75%的浓度存在于检测样品中。LMWS1片段是抗体的FAb功能区之一在抗体铰链区内的位点处发生蛋白质水解而分离的结果，其分子量约100 KDa， 而LMWS2片段是FAb和Fc功能区的混合物(均为约50KDa)“。游离Fc功能区是两个FAb臂裂解的结果。在这些产品相关杂质中LMWS1最难分离，这是因为其大小与单体不存在明显差异，并且洗脱位置处于丰度更高的IgG单体的拖尾区域内。由于主峰拖尾的些微增加都将对低丰度峰的分离度和积分面积产生显著影响，因此在分离中拖尾主峰的低丰度物质变得更加难以分离和定量。为分析该影响的程度，我们对包含不同浓度LMWS1(峰面积约为0.6%~4.1%)的多种mAb混合物进行了评估。在LC系统上使用几种不同规格的SEC色谱柱对这些样品进行评估，并特意将5o。体积调整为介于9.5pL和56.7pL之间。 图3.样品色谱图展示了使用内径4.6mm、柱长300mm且粒径为1.7 pm的SEC色谱柱获得的英夫利昔单抗降解样品的最佳分离结果。该LC系统的5-sigma柱外扩散(5o。)为9.5pL。峰鉴定结果为：高分子量(HMWS， 约300KDa)、mAb单体(约150KDa)、由一个Fab和一个Fc功能区组成的2/3mAb片段(LMWS1，约100KDa)以及共流出的Fc和Fab功能区(LMWS2，约50KDa)。在该样品中测得的HMWS、LMWS1片段和LMWS2片段的峰面积百分比分别为0.75%、4.1%和1.7%。 在内径4.6 mm(1.7 pm SEC颗粒)、柱长150mm和300mm的色谱柱上评估英夫利昔单抗样品得到的色谱图结果见图4和图5，在内径7.8 mm(3.5 pm SEC颗粒)、柱长300 mm的色谱柱上得到的结果见图6。由于LMWS1片段在内径7.8 mm(3.5 pm)、150mm色谱柱上未得到分离，因此其结果未展示。使用所有四种色谱柱测定HMWS的定量结果汇总见图7.我们观察发现，对于内径7.8mm(3.5um)色谱柱和4.6×300 mm (1.7 pm)色谱柱， HMWS与mAb单体之间的分离度以及HMWS峰面积百分比受柱外扩散增加的影响最小。其部分原因在于，两个峰之间最初达到的高分离度(R>1.6)、上述三种色谱柱产生的峰体积以及洗脱顺序使丰度明显更高的单体的峰拖尾不影响分离度。另外，仔细观察色谱图发现HMWS峰具有一定程度的多分散性，由于分离度值主要取决于HMWS峰中流出的自相关形式的大小分布，因此该值看起来更加一致。 图4.色谱图放大视图，展示使用内径4.6 mm、柱长150mm且粒径1.7 um的SEC色谱柱时柱外扩散(o)对LMW1mAb片段分离的影响。在测试的o条件下评估每种样品中LMWS1片段的峰面积百分比见左列，其范围为4.1%~1.5%。峰鉴定结果如图3所示。 图5.色谱图放大视图，展示使用内径 4.6 mm、柱长300mm且粒径1.7pm的 SEC色谱柱时柱外扩散(o)对LMWS1 mAb片段分离的影响。在测试的o.. 条件下评估每种样品中LMWS1片段 的峰面积百分比见左列，其范围为 4.1%~0.6%。峰鉴定结果如图3所示。 图6.色谱图放大视图，展示使用内径7.8 mm、柱长300mm且粒径3.5 pm的SEC色谱柱时柱外扩散(o。)对LMWS1mAb片段分离的影响。在测试的o条件下评估每种样品中LMWS1片段的峰面积百分比见左列，其范围为4.1%~1.5%。峰鉴定结果如图3所示。 图7.展示图4至图6所示色谱图中HMWS峰的定量比较结果。此外，还包括使用内径4.6mm、柱长150mm且粒径3.5 pm的SEC色谱柱时对HMW的评估结果。根据文中所述方法测得的系统扩散对单体和HMWS峰之间的USP分离度(带有方形标记的蓝色虚线)以及HMWS峰面积积分百分比(带有圆形标记的棕色实线)作图。样品进样体积和流速与色谱柱内径成正比。 除该因素外，我们还观察到4.6×150 mm (1.7 pm)色谱柱的分离度随系统扩散的增加而显著降低。这是由于该色谱柱产生的峰体积较小所致(图8)。但是，利用该色谱柱得到的HMWS百分比峰面积仍然一致。值得注意的是，当5o大于约25pL时， 7.8×150 mm (3.5pm)色谱柱提供的HMWS分离度与4.6×150 mm (1.7 um)色谱柱相当(请记住，由于色谱柱以相同的线性速度运行，因此其运行时间相同)；4.6×150 mm(1.7 pm)色谱柱的塔板数(基于在最低5o的尿嘧啶评估)高出84%。我们在比较300mm色谱柱时发现了类似的趋势，但是4.6×300 mm (1.7 um)色谱柱在5o接近60pL的条件下才行才表现出优势。如果我们基于上述色谱柱产生的5o峰宽考虑IgG峰体积(图8)，就能发现较长柱长、较大内径和较大粒径的色谱柱受柱外扩散影响不大的原因。例如，将内径7.8 mm(3.5pm)色谱柱产生的峰体积与内径4.6 mm(1.7 pm)色谱柱产生的峰体积进行比较时，观察到峰体积增加了近4倍。我们还观察到，当柱长从150mm增加至300 mm时，峰体积增加了约50%。这些结果表明，作为HMWS的SEC分析通用标准，LC系统的5o扩散体积应小于25pL才能使4.6×150 mm (1.7pm)色谱柱发挥显著的样品通量或分离度优势，如果是4.6×300mm (1.7 pm)色谱柱，5o扩散体积应低于60 pL。 图8.展示了Waters BEH200 SEC蛋白混标中IgG峰的5o峰体积(4.4%峰高处峰宽)估算结果。峰体积已针对5-sigma系统扩散体积进出了修正。 实测内径4.6 mm(1.7 um)色谱柱和内径7.8mm(3.5pm)色谱柱的性能差异将取决于样品和系统。因此，应对1.7 pm和3.5 pm粒径SEC色谱柱的性能进行评估，这是考虑到在3.5 pm粒径色谱柱可提供所需分离度的情况下，使用该色谱柱可降低系统扩散产生的影响，并降低色谱柱成本。但是，使用这种大规格色谱柱存在一个大多数SEC分析通常会忽视的问题-它会导致流动相和样品体积增加。值得注意的是，我们并未对填充3.5 pm颗粒的4.6mm内径色谱柱进行比较。虽然填充3.5 pm颗粒的4.6mm小内径色谱柱可减少流动相用量，但小内径色谱柱在HPLC系统上获得的分离度将会降低。这是由色谱原理决定的，即色谱柱固有分离度虽然与色谱柱内径基本无关，但减小色谱柱内径将减小峰体积，导致柱外扩散对分离度的影响放大。 接下来，我们将检测柱外扩散对LMWS与mAb单体分离的影响。基于图4至图6所示色谱结果得出一系列图(图9)，显示柱外扩散对单体与LMWS1峰之间峰谷比(左侧坐标轴)以及LMWS1峰面积百分比(右侧坐标轴)的影响。由于LMWS1片段在7.8×150 mm (3.5 um)色谱柱上未得到分离，因此省略了该色谱柱的结果。比较两根4.6 mm内径(1.7 pm)色谱柱的分离度(P/V)结果，我们能够很容易看出，使用柱长为300mm的色谱柱能够显著提高mAb单体和LMWS1峰的分离度。这主要是塔板数或分离性能增加了大约一倍所致。但从图8可以看出，较长色谱柱增加峰体积的同时，也会在更大程度上减小柱外体积的影响。 图9.图4至图6所示色谱图中LMWS1测定的定量比较结果。 图9.图4至图6所示色谱图中LMWS1测定的定量比较结果。 根据文中所述方法测得的系统扩散对LMWS1mAb片段的峰谷比(带有方形标记的蓝色虚线)和LMWS1峰面积积分百分比(带有圆形标记的棕色实线)作图。橙色圆圈表示%LMWS1测定值数据点，其中LMWS1峰的P/V比≤1.01。样品进样体积和流速与色谱柱内径成正比 这一更高的分离度还伴随着更低的检测限，我们将其定义为P/V比大于1.01。如上所述， 300mm色谱柱能够在更高的5o水平下分离LMWS1峰。比较定量结果(%LMWS1)可以看出，在测试的整个5o水平范围内，LMWS1片段的百分比相对于150mm柱长色谱柱的5o。。始终不一致，而对于300mm柱长的色谱柱，LMWS1百分比测定值更为一致(但当5o水平超过30pL时，开始出现明显的偏差)。应当注意，在评估的5o体积范围内，对于这三种色谱柱配置以及7.8×150 mm (3.5 pm)色谱柱， LMWS2峰均得到良好分离且定量结果一致。 将7.8×300 mm (3.5 pm)色谱柱与4.6×300 mm (1.7 pm)色谱柱进行性能比较时，我们观察到在5o水平为30pL时， P/V比平均仅下降7%~20%，并且在5o水平为42pL或更高时，7.8×300 mm(3.5pm)色谱柱的P/V比具有更高的重现性。但不同于4.6×300 mm (1.7pm)色谱柱，在5o增加至22pL以上时，这种较大规格色谱柱的LMWS1定量结果更一致。总结以上LMWS1的SEC分析结果，由于随着系统扩散的变化可观察到显著的定量结果差异，因此不建议在验证方法时使用4.6×150 mm (1.7 pm)色谱柱。在维持5o水平<25pL的条件下，4.6×300 mm (1.7 pm)色谱柱可得到最高分离度和可靠的LMWS1定量，但仍应严格控制所用LC系统中的系统扩散。在低扩散LC条件下，使用7.8×300 mm (3.5pm)色谱柱得到的分离度和灵敏度明显低于4.6×300 mm(1.7 pm)色谱柱，但其定量结果相对于系统扩散一致。此外，在5o水平高于40pL的条件下，7.8×300 mm (3.5pm)色谱柱可为mAb分离提供最高分离度。 当需要分析LMWS1时，在采用7.8×300 mm (3.5pm)色谱柱得到的分离度不足，且所用LC系统不支持4.6×300 mm (1.7 pm)色谱柱使用的情况下，最佳选择是串联两根7.8×300 mm (3.5pm)色谱柱以得到600 mm的总柱长。尽管该方法会延长分析时间，但却更可靠、更易于转换。通过比较4.6×300 mm (1.7 pm)色谱柱、7.8×300mm (3.5 pm)色谱柱和两根串联运行的7.8×300mm (3.5 pm)色谱柱上所得曲妥珠单抗的LMWS1分离结果，展示串联多根SEC色谱柱的使用(图10)。我们并未在上述色谱柱之间进行严格的方法转换，而是选择使用这些色谱柱配置的常用流速：4.6×300 mm (1.7 pm)色谱柱采用0.4mL/min； 7.8×300 mm (3.5 pm)色谱柱采用1.0 mL/min或0.5mL/min4.6×300 mm (1.7 um)色谱柱在ACQUITY UPLC H-Class Bio系统(5o=20pL)和ACQUITY Arc Bio系统(5o=34pL)上均进行了评估。从这些比较结果可以看出，使用ACQUITY UPLC H-Class Bio系统可在4.6×300mm (1.7um)色谱柱上有效分离LMWS1和mAb单体(估算相对丰度约0.3%)(P/V=1.32)，而ACQUITY Arc Bio系统的高扩散则导致分离度下降，可能使LMWS1定量结果不可靠(P/V=1.03)。请注意， HMWS和LMWS2在两种LC系统上均得到充分分离。 图10.色谱图放大视图，展示ACQUITY UPLC H-Class Bio(30cm柱温箱， 5oc=20pL)和ACQUITY Arc Bio(5o。c=34pL)的柱外扩散(oec)对曲妥珠单抗的HMWS以及mAb片段LMWS1和LMWS2的SEC分离影响。上方两个色谱图比较了在ACQUITY UPLC H-Class Bio系统(A)和ACQUITY Arc Bio系统(B)上以0.4mL/min的流速使用4.6×300 mm (1.7 pm)色谱柱获得的结果。下方左侧色谱图(C)使用7.8×300 mm (3.5um)色谱柱获得，下方右侧色谱图(D)使用两根串联的7.8×300 mm(3.5pm)色谱柱获得，所用流速均为1.0 mL/min。流动相为25mM磷酸钠和400mM氯化钠， pH 7.2。进样体积为5pL(A和B)、15 uL (C)和21pL (D)。ACQUITY UPLC H-Class Bio和ACQUITY Arc Bio的UV流通池光程分别为5mm和10mm. 相比于在ACQUITY Arc Bio系统上使用4.6×300 mm (1.7pm)色谱柱， 在ACQUITY Arc Bio系统上使用单根7.8×300 mm (3.5pm)色谱柱以1.0 mL/min的流速运行方法时，观察到的组分分离度更低，该情况与预期结果一致。将流速将至0.5 mL/min未能充分分离LMWS1峰(数据未显示)。但是，在1mL/min的流速下使用串联的两根7.8×300 mm (3.5 pm)色谱柱时，其分离度(P/V=2.1)得到显著改善，并且优于ACQUITY UPLC H-Class Bio系统配置的4.6×300 mm (1.7 pm)色谱柱所得结果(P/V=1.32)。这在很大程度上是由于ACQUITYUPLC H-Class Bio系统的5o值20pL，降低了单体和LMWS1之间分离的理论最大分离度(P/V)。该色谱柱上所得英夫利昔单抗LMWS1的P/V比对应该情况有明显表现(见图5)。虽然这种串联色谱柱方法使分析时间增加约2倍，并且需要使用更多样品和流动相，但这是一种可靠而灵敏的方法。由于该方法得到的峰体积巨大(约550pL)，因此即使5o扩散体积大于60 pL， 预分分离效率应该也不会受到明显影响。 结论 我们尝试系系性评估LC系统柱外扩散与SEC粒径、色谱柱内径和柱长在mAb HMWS以及LMWS杂质分析中的相互影响。考虑到上述关系，我们开发了一套用于匹配沃特世UPLC和HPLC SEC色谱柱与首选用于SEC分离的三种沃特世LC系统的系用指南(图11)。 色谱柱 杂质 ACQUITY UPLCH-Class Bio 30cm柱温箱(5o=20-25 pL)15 cm柱温 箱(5o=8-10 uL) ACQUITYARC Bio 30cm柱温箱 (5o=24-34uL) Alliance"" 30 cm柱温箱(5o =45-66 pL) 1.7 um， 4.6×150 mm** HMWS &LMWS2 LMWS1 1.7 um， 4.6 × 300 mm HMWS &LMWS2 LMWS1 3.5 um， 7.8×150 mm*** HMWS &LMWS2 3.5 pm， 7.8 ×300 mm HMWS &LMWS2 LMWS1 *5oLC扩散的范围考虑到系统配置的变化，包括柱温箱和检测器的类型** ACQUITY UPLC H-Class Bio系统使用15cm柱温箱时 *** LMWS在3.5 um，7.8×150 mm色谱柱上未得到有效分离 *** LMWS在3.5 um，7.8×150 mm色谱柱上未得到有效分离 图11.展示了匹配沃特世UPLC和HPLC SEC色谱柱与三种常用于mAb及其它蛋白质SEC分析的沃特世LC系统的通用指南。虽然这些指南可能不适用于所有分离，但其大体上提供了一个合理的起点。这些指南主要基于所示LC系统的柱外扩散范围(5o)，但也考虑到了耐压能力。个别LC系统可能偏离所述50范围。LMWS2建议针对的是与完整单体实现基线分离的片段杂质，而LMWS1杂质建议则特别适用于非基线分离的片段。三个绿色峰表示所开发的SEC方法可能易于转换和验证。两个黄色峰表示可以实现分离，然而该方法增加了不易转换或验证的风险。单个红色峰表示该方法可能无法产生所需的分离，并且可能无法验证。这些建议可扩展用于任何一种多根色谱柱的串联使用配置。 此外，这些数据表明，在某些SEC方法的稳定性测试中，柱外扩散的评估可能是一个重要变量。最后要注意的是，如果由于LC系统具有无法纠正的明显柱外扩散情况而阻碍了开发方法向其转换，则降低该方法的流速或增加色谱柱柱长可有效缓解其影响，且不会从根本上改变分离的选择性。 读者还可参阅本应用纪要的姊妹篇《评估LC系统扩散对体积排阻色谱分析蛋白的影响》(沃特世应用纪要，部件号：720006337ZH)。除了SEC方法开发建议外，该出版物还包括SEC和系统扩散的其它数据和理论讨论。 致谢 作者在此由衷感谢Paula Hong提供沃特世LC系统扩散数据。 ( 参考文献 ) ( 1 . 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International Journalof Peptide and Protein Research.1996，48，48-55. 扫一扫，关注沃特世微信 沃特斯中国有限公司 Waters 沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-52093866 上海：021-61562666 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 广州：020-2829 6555 成都：028-6765 3588 香港：852-29641800 Waters、 The Science of What’s Possible、ACQUITY、Alliance、Arc、Empower、UPLC和XBridge是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有 免费售后服务热线：800(400)820 2676wWw.waters.com LC系统扩散对单抗聚集体和片段SEC分析的影响：基于方法选择最佳色谱柱规格 应用优势 1）教学式系统展示LC系统扩散对mAb的SEC分离的影响。2）指导用户根据所使用的LC系统和分析方法要求(包括分离度、灵敏度、重现性和可转换性)选择最佳的SEC色谱柱配置。3）展示ACQUITY™ UPLC™ H-Class Bio和ACQUITY Arc™ Bio系统的SEC分离性能。简介过去，体积排阻色谱 (SEC)是评估重组蛋白生物治疗药物中非共价蛋白质聚集体 (高分子量物质[HMWS])时应用最广泛的方法。但近年来，由于SEC色谱柱和LC系统的性能提升，使用SEC对这些样品中的蛋白质片段(低分子量物质[LMWS]) 在非变性的条件下进行分析的方法也越来越受到人们的关注。其中最受关注的，是针对铰链区水解降解所产生IgG单克隆抗体(mAb)片段的分析方法。相较于将单体(约150KDa)与二聚体和更高分子量形式HMWS(≥300 KDa)分离的传统分离方法，LMWS片段(分子量为mAb单体分子量三分之二(约100 KDa)的mAb主要形式)的分离可能更具挑战性。这是由于LMWS与单体的大小(流体动力学半径)相比于单体与HMWS蛋白质的大小更加接近。由于蛋白质洗脱顺序中低浓度LMWS峰作为主(单体)峰上的拖尾肩峰洗脱，使分离难度进一步增加。虽然使用粒径为亚2µm的SEC色谱柱能够提高效率，从而提高HMWS和LMWS的分析通量，但由于色谱柱硬件和填料的限制，这些高柱效SEC颗粒仅适用于内径为4.6mm或更小的色谱柱。使用HPLC色谱系统时，通常因为SEC粒径为3µm 及以上，可以选择7.8mm内径的色谱柱。虽然许多HPLC系统也能够在这些内 径为4.6mm的SEC色谱柱所需流速和背压下运行，但存在一个经常被忽视的事实，即典型HPLC配置的柱外扩散相对大于这些UPLC SEC色谱柱所产生的峰体积，导致观察到的峰分离度明显降低。柱外扩散可以看作是样品在通过不含色谱柱的LC系统流路时发生的体积增加现象。结论 我们尝试系统性评估LC系统柱外扩散与SEC粒径、色谱柱内径和柱长在 mAb HMWS以及LMWS杂质分析中的相互影响。考虑到上述关系，我们开发了一套用于匹配沃特世UPLC和HPLC SEC色谱柱与首选用于SEC分离的三种沃特世LC系统的通用指南。此外，这些数据表明，在某些SEC方法的稳定性测试中，柱外扩散的评估可能是一个重要变量。最后要注意的是，如果由于LC系统具有无法纠正的明显柱外扩散情况而阻碍了开发方法向其转换，则降低该方法的流速或增加色谱柱柱长可有效缓解其影响，且不会从根本上改变分离的选择性。 读者还可参阅本应用纪要的姊妹篇《评估LC系统扩散对体积排阻色谱分析蛋白的影响》 (沃特世应用纪要，部件号：720006337ZH)。除了SEC方法开发建议外，该出版物还包括SEC和系统扩散的其它数据和理论讨论。