促红细胞生成素中肽图分析检测方案(液相色谱仪)

利用Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱进行高分离度的 EPO糖肽图分析 应用简报生物制药 作者 摘要 James Martosella， Phu Duong 及 Alex Zhu 安捷伦科技公司 2.7 pm Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱专为改善多肽分离和肽图分析应用而设计。该色谱柱采用了表面多孔技术，能够实现复杂多肽混合物的快速有效分离。本文以重组人促红细胞生成素(rhEPO)的胰酶分解物作为糖肽分析的消化物模型，展示了 AdvanceBio肽图分析色谱柱卓越的肽图分析性能。与很多蛋白治疗药物类似， rhEPO 在生产过程中发生了修饰，因此表现出广泛的异质性。AdvanceBio 肽图分析色谱柱采用了优化的C18涂层技术，能在一个很宽的洗脱范围内为多肽分析提供卓越的选择性和分离度，以增强糖肽片段的分离，从而实现其快速、有效和灵敏的质谱分析。 Agilent Technologies 联用反相 HPLC 及电喷雾电离质谱(ESI/MS) 进行蛋白水解多肽的肽图分析已成为鉴定生物治疗产品及确认其功效的首选方法[1]。利用液相色谱/质谱联用 (LC/MS)进行肽段分析是发布此类产品的重要前提，而且在完成蛋白表征策略中具有重要作用。例如，为了确保重组蛋白治疗药物的稳定性，需要在整个保质期内长期监测药物产品的重要修饰，如糖基化修饰。糖基化分析虽然可在完整蛋白的水平上进行，但是糖肽图分析能提供其他重要信息，例如序列信息、质量分析、以及糖基化位点的鉴定。 本文采用 rhEPO 蛋白作为一种糖蛋白模型，利用 2.7 um AdvanceBio肽图分析色谱柱对其进行高分离度的肽图分析和糖肽 LC/MS分析。 该色谱柱是专为改善肽图分析应用中的分离问题所设计的，它可为高效肽图分析(例如 rhEPO 肽图分析和增强糖肽发掘应用)提供更高的分离度、灵敏度和选择性。此外， 2.7 um 的表面多孔颗粒允许在较高流速下使用更长的色谱柱(2.1×250mm)， 从而可在 HPLC 级色谱柱压力下实现亚 2 pm 粒径色谱柱的分离度。 材料与方法 ( 重组人 EPO 购自 Creative Biol a b公司(美国雪莉)。三氟乙酸购自西格玛奥德里奇公司(美国圣路易斯)，异丙醇和乙腈购自霍尼韦尔公司(美国马斯基根)。高品质的序列级胰酶来自安捷 伦科技的 Stratagene 部门。 ) ( 将胰酶加入约含有 4.2 mg (2.1 mg/mL， 2 mL)EPO 的溶液中，获 得蛋白酶消化物。底物与酶的比例为50：1(重量比)。混合溶液在37℃下孵育12小时。将样品储存于-70℃以终止消化。经 过验证，最终获得3.78 mg (2.1 mg/mL， 1.8 mL) EPO 消化物。 ) 其中使用了配有自动进样器 (Hip-ALS)、二元泵、柱温箱(TTC)及二极管阵列检测器 (DAD) 的 Agilent 1200 Infinity LC 系统， 并与Agilent 6224 TOF LC/MS 联用。使用 Agilent MassHunter 定性分析软件及 Agilent MassHunter BioConfirm 软件进行数据处理。 TOF MS 参数 在正离子、棒状图模式下采集谱图。 气体温度： 350°C 干燥气体： 10L/min 雾化器： 45 psi 毛细管电压： 3500V 碎裂电压： 170V 锥孔电压： 65V 八极杆1RF： 750 V MS： 4Hz 质量数范围： 100至7000 m/z 参比质量： 149.02332 922.009798 采集模式： 扩展动态范围模式(2GHz) 色谱条件 色谱柱： Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱， 2.1x250 mm， 2.7pm (部件号651750-902) 洗脱液： A， 水+0.1%甲酸(v/v)； B， 乙青+0.1%甲酸 (v/v) 进样体积： 5 uL (2 pg/pL) 流速： 0.4 mL/min 梯度： 时间(分) B的百分含量 0 3 28 45 33 60 34 95 温度： 55 °C 甲酸 (FA) 离子对添加剂存在条件下的分离情况以测定其对峰保留和峰形的影响。AdvanceBio 肽图分析色谱柱可提供优异的分离性能，并能与 TFA 及 FA 离子对添加剂兼容。优化的分离结果如图1所示，其中展示了 rhEPO肽图的最佳分离图谱。2.1×250mmAdvanceBio 肽图分析色谱柱以及优化的色谱条件(使用FA作为离子对添加剂)可实现 rhEPO 胰酶消化物的高分离度分离，从而可在整个梯度过程中提供极窄的峰宽、更高的灵敏度并能获得极好的选择性，因此这种分离可离 ESI/MS分析高度匹配。 图1.反相 rhEPO肽图，使用2.1× 250 mm， 2.7 um Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱(请见色谱条件部分) rhEPO 胰酶消化物的快速 ESI-MS肽图分析 为获得所需的分离度，采用 2.1× 250 mm 色谱柱进行肽图分析通常至少需要2个小时。此外，重新平衡和仪器运行间的周期时间会延长总体分析时间，从而大大影响实验室的效率。虽然需要 加快肽图分析，但保证分离度至关重要。图2展示了使用2.1×250mm色谱柱进行快速 LC/MS分析的总离子流图(TIC)，整个分析过程只需不到35分钟的时间。整个梯度中优异的峰保留、峰形和分离度均表明该方法是进行肽图分析LC/MS 验证的可靠选择。 图2.使用2.1× 250 mm Agilent AdvanceBio 色谱柱的 LC/MS分析总离子流图，只需不到35分钟即可完成 AdvancedBio 肽图分析色谱柱在实现更快分析的同时，并未降低rhEPO 的色谱分离度。图3显示了由Agilent MassHunter 分子特征提取(MFE)软件所得的结果。 MFE 是一种可从复杂数据中找到化合物信息并为每个化合物创建平均 MS 谱图的算法。之后，这些 MFE 化合物结果将与 rhEPO 蛋白序列进行匹配。这一仅需34分钟的 LC/MS 方法得出的 rhEPO 蛋白序列覆盖率为 100%。 采集时间 (min) 图3.利用2.1×250 mm Agilent AdvanceBio 色谱柱可获得 100% rhEPO 序列覆盖率。采用 Agilent MassHunter 定性分析软件的MFE功能获取数据 rhEPO 的预测分子量为24，000道尔顿，而其糖基化形式的表观分子量为30，400道尔顿，因此可将其作为一种有效的糖蛋白模型来验证 AdvanceBio 肽图色谱柱的糖肽分析能力。图4为从图3中总的 LC/MS分析中提取的肽段糖基化谱，而表1列出了相关的 质量和糖基化序列信息。利用 AdvanceBio 肽图分析色谱柱可鉴定出42个独特的糖肽，这证明了该色谱柱在高复杂度肽图分析中的性能优势及实用性，在这类应用中，翻译后修饰信息(例如糖基化)对完整蛋白的表征至关重要。 采集时间(min) 图4. MFE 提取的肽段糖基化谱，使用2.1×250 mm Agilent AdvanceBio 色谱柱。采用 Agilent MassHunter 分子特征提取 (MFE)功能基于 Agilent 6224 TOF LC/MS获取数据 表1.重组人 EPO 的预测N-连接多糖修饰和序列(续) 保留时间 糖肽精确分子量 预测的多糖修饰[序列位置] 序列 19.896 1992.853 1*1000 0A 0G [A147] VYSNFLR 22.134 7293.135 1*1000 0A 0G 1*3031 0A 1G [A24A36] VLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTK 29.128 7842.206 1*0100 0A 0G 1*G0F (NGA2F)/G1F[A24A36] EAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKR 22.303 6912.043 1*0100 0A 0G1*3011 0A 1G [A24A36] VLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTK 17.671 6095.53 1*0100 0A 0G1*2010 0A 0G (G1) [A24A36] EAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWK 结论 本文采用重组人促红细胞生成素消化物为例，证明了 Agilent2.7 um AdvanceBio 肽图分析色谱柱在快速、有效的 LC/MS 肽图分析中具有卓越的效能。2.1×250 mm 的色谱柱尺寸以及针对质谱分析优化的色谱条件提高了整个梯度中 rhEPO 胰酶消化物的分离度，证明该色谱柱具有极佳的选择性和保留特征，这对获取清晰完整的肽图非常关键。AdvanceBio 肽图分析色谱柱使rhEPO 的 ESI/MS分析获得了100%的序列覆盖率并鉴定出42个糖肽，证明该色谱柱是高复杂度肽图分析应用的极佳选择。 ( 参考文献 ) 1.L. J. Campbell， J. Y. Le Blanc. Bioanalysis， 3， 645 (2011). 更多信息 这些数据代表典型结果。有关我们产品和服务的详细信息，请访问我们的网站： www.agilent.com/chem/cn www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2013 ( 中国印制 ) 2013年2月11日 5991-1813CHCN Agilent Technologies 2.7 μm Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱专为改善多肽分离和肽图分析应用而设计。该色谱柱采用了表面多孔技术，能够实现复杂多肽混合物的快速有效分离。本文以重组人促红细胞生成素(rhEPO) 的胰酶分解物作为糖肽分析的消化物模型，展示了AdvanceBio 肽图分析色谱柱卓越的肽图分析性能。与很多蛋白治疗药物类似，rhEPO 在生产过程中发生了修饰，因此表现出广泛的异质性。AdvanceBio 肽图分析色谱柱采用了优化的 C18 涂层技术，能在一个很宽的洗脱范围内为多肽分析提供卓越的选择性和分离度，以增强糖肽片段的分离，从而实现其快速、有效和灵敏的质谱分析。