nanoLC中分离性检测方案(液相色谱仪)

WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE."结果与讨论柱前扩散如需下载此海报副本，请访问 WWW.WATERS.COM/POSTERS特世公司 高效的nanoLC方法在低流速条件下仍可保持出色的灵敏度，因此是一种最优的自下而上式蛋白质组组LC-MS分析分离方法。增强的灵敏度和分离效率在很大程度上提高了蛋白质组学的分析质量，通过少量样品即可获得大量的蛋白质和肽鉴定数据。但是，要完全实现此目标，必须精确优化nanoLC的分析条件。 本实验在“富集和洗脱”nanoLC-MS配置上对比了几种市售的捕集柱和色谱柱，通过测量肽峰宽对蛋白质组学的分离效率进行了测定。随后将得到的分离效率与固定相单独测定的保留性进行对比。 传输管路的柱后扩散影响通过传输管路切短后的变化进行评估，可在显微镜 下检视切断面，确定切割质量，然后评估其对扩散的影响。如果需要完全平 整的表面，可对切断面进行抛光处理 柱外扩散是导致分析效率和灵敏度降低的一个重要因素，色谱系统中每个流路组件都可能影响到系统的扩散效应。减少色谱柱和系统中其他组件的扩散影响后，最终即可获得所测定的色谱峰(图1)。因此，确保柱外扩散明显小于色谱柱扩散是一项非常重要的工作。由于系统本身的体积较小，相比于较大规格的LC方法，系系扩散对nanoLC方法的影响更大。 实验详细信息 C保留性测试设置 LC： ACQUITY UPLCTMI-Class，带固定定量环进样器 MS： XevoTM TQ-S带通用离子源流动相A：；0.1%甲酸水溶液 流动相B：0.1%甲酸的乙腈溶液 样品： 1pmol/pL肽昆标溶液(含0.1%TFA)， 来自MassPREP肽混标 我们研究了会对“富集和洗脱”型nanoLC的柱外扩散产生影响的两个主要原因以及降低此影响的方法。本文首先将介绍柱上再聚焦对降低柱前扩散的积极影响，随后将对柱后传输管路和管路连接的扩散特性进行评估。 (部件牛：186002337)的12种肽和MassPREP"肽保留时间标#口 i件 准品(部件号：186006555)进样体积：1pLPLNO进样(采用10pl定量环) 分离：90%流动相B冲洗色色柱6 min 流速为0.2 mL/min， 流动相B在60 min内从0%升至40% 色谱柱：2.1 mm × 100 mm，5 pm， 柱温为30℃ 测试的C固定相Waters HSS T3 100A 样器泵 )一O 质谱仪 Waters BEH C.. 130A +SS C.. 130A ologyNaters CSH Waters Symmetry"C.100A csHTechnolo /endor T，‘AP’C.100AA 0双 +0入口组件件+：+0°捕集柱 FO检测器 富集和洗脱”型nanoLC/MS设置LC ACQUITY UPLCTM M-Class双BSM反向洗脱：带固定定量环进样器MS： XevoTM TQ-S带Nanospray离子源+PicoTip发射器流动相A；0.1%甲酸水溶液液 共前扩 柱后扩散 流动相B：0.1%甲酸的乙腈溶液 。图1.典型的“富集和洗脱”型nanoLC-MS设置和扩散原因的示意图。 样品； 2 fmol/uL水溶液+0.1%TFA MassPREP"烯醇酶酶解磷酸肽混标(部件号：186003286)进样体积：3pl部分定量环进样(采用20uL定量环)色谱普： 7.5pm×250 mm， 亚-2pm颗粒，温度为35℃ 捕集条件：99.5：0.5A/B，1155pLjL//mniirn x 2 min 梯度条件 流速 A300 nL/min 9510 miinin 300 nL/min55 min 300 nL/min57 min 300 nL/min62 min 300 nL/min65 min 300nL/min110n 300 nL/min 检测条件：7种肽的MS SRM(图2中的条件)10s的峰内有25个数据点 测试的捕集柱和纳米色谱柱 mWaters nanoEase"M/Z捕集柱和色谱柱nanoEEase"M/Z Symmetry C捕集柱， 5 pm， 181800 ulnmx20mm(部件号号； 186008821)nanoEase"M/ZBEHC色谱柱， 1.7 pm， 75 um x250 mm(部件号：186008795)nanoEas /Z HSS T3色谱柱， 1.8 umm，7 x250mm(部件号：186008818)。 Vendor T， ‘AP’捕集柱和色谱柱AP'S 捕售小柱： 51rmH，300 pmxix55 mm 图2.使用HSST3色谱柱和Symmetry C.捕集柱分离特征肽的示例色谱图。图中 的表格列出了7种特征肽及其SRM条件。 ‘AP’C色谱柱， 2 pm， 75x250 mm 分析物在进入色谱柱之前，通过各种组件(例如，进样定量环、切换阀、捕集柱、管路和接头)时会发生柱前扩散，从而导致谱带变宽。展宽的分析物谱带 可以被保留在色谱柱的柱头，形成窄谱带。此现象称为再聚焦，可以缩小谱 色谱柱 捕集柱 10%峰高处的峰宽(PW10%)6) T3 T19 T18 T22 T43p D T42 T32 HSST3 SymmetryC18 9.7 9.4 4.7 9.7 9.3 289 HSST3AP'C18 15.211.2 14.59.8 10.2 267 BEH C18 Symmetry C1813.08.61 8.0 346 9 BEH C18 ‘AP'C18 30.11 112.27.7 1 8.88.8 31313 AP'C18 Symmetry C187.97.512.610.09.310.19.2 284 ‘AP'C18 ‘AP'C18 7.9 114.3 11.211.313111.0 242 图6和表1.常用于蛋白质组学分析的C色谱柱-捕集柱组合的色谱性能。 即使将毛细管切割面进行完全抛光处理以避免任何死体积，色谱峰宽也没有明显改变。使用10英寸传输管路时的峰宽处于使用20英寸传输管路所得峰宽的实验不确定度范围(<5%)之内。开管毛细管中的扩散及其对峰宽的影响可通过Taylor-Aris方程进行估算3 ( = 元1 FL 方程1 ) ( 其中o?：峰值方差， r ：管路半径，L： 管 路长度，F：流速， D：扩 散 系数 ) ( 在当前实验条件(D~1x105cm/ s ， F=300 nL/min)下， 20 pm ID×10英寸 毛细管预期会对峰值方差产生1.66nL²的影响。对于10s宽的色谱峰，该柱柱 ) 扩散仅使峰宽增加了0.7%。由于短的管路并不能明显提高效率，反而会带来极大的死体积风险，导致谱峰明显变宽，因此我划强烈建议用户不要自行切割柱后传输输路。 图7.典型带内置柱后传输管路的nano色谱柱 如果未正确处理毛细管切割面，切割管路将导致色谱分离效率严重下降(图8和9). 因为不平整的毛细管后端与nanospray进行接头连接时，会产生较大的死体积。圆盘刀具比瓷片切割刀具的切割面更整洁，但切割面的平整度仍非常难以预测，并且经常无法实现垂直切割。 图9.毛细管横截面的显微图像示例， a)使用瓷片切割刀切割， b)使用圆盘刀具(ShortixTM切割器)切割，以及c)多次抛光处理后， 结论 nanoLC-MS中的外扩散可明显影响色谱效率 ( 通过选择合适的nano色谱柱和捕集柱可以有效地降低柱前扩散，捕集柱和色谱柱固定相之间的保留性差异以及固有的柱效是选择的重要参考因 素. ) 柱后传输管路的扩散影响并没有想象中的大，相比于管路扩散，不正确的传输管路切割会造成更严重的色谱性能降低。 ( 参考文献 ) ( 1 . M.C. J ung and M. Wanninger， Consideratio ns i s for sel e c t ing the optimstationary phases for proteomic trap-and-elute nanochromatography hite Paper， 720006063EN (2017 ) ( 2. . U .D. Neue， HPLC Col u mns： theory technology and practice， Wiley-VC (1997 ) ( 3 l . M. Gilar et al， Implications of colum n peak capacity on the separation o of complex peptide m ixtures in single - and two-dimensionall high-pen IGG iaid remategrarhy tog A19 183(2004 ) 本文首先将介绍柱上再聚焦对降低柱前扩散的积极影响，随后将对柱后传输管路和管路连接的扩散特性进行评估。