曲妥珠单抗中通过IdeS酶解和还原获得的小分子抗体亚基片段检测方案(液质联用仪)

「应用纪要1WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. [应用纪要1 使用ACQUITY QDa质谱检测器对单克隆抗体亚基进行工艺监测以快速监测关键品质属性 Brooke M. Koshel、 Robert E. Birdsall和Ying Qing Yu 应用优势 获取补充质谱数据，使用MassLynx软件中的MaxEnt""去卷积算法进行亚基分析 对亚基数据进行常规监测可及时检测生产过程中的变化，从而更有效地节省成本 进行亚基糖型分析，以快速筛查批次间一致性 沃特世解决方案 ACQUITY UPLCH-Class系统 ACQUITYQDa°质谱检测器 ACQUITY UPLC可变波长紫外(TUV)检测器 带有MaxEnt1的MassLynx软件4.1版 ACQUITY UPLC BEH蛋白分析专用柱 关键词 单克隆抗体，亚基分析， ldeS酶解， ACQUITYQDa质谱检测器 简介 蛋白类治疗药物是一类快速发展的药物。由于它们的生产工艺复杂，在开发和生产过程中，我们需要通过各种检测手段来监测其关键品质属性(CQA)，以确保产品质量和安全性。蛋白质糖基化修饰已成为一项重要的品质属性，因为研究表明半乳糖基化修饰与某些市售重组单克单抗体(mAb)的细胞毒性有关。相关分析方法包括基于荧光和MS技术的释放-标记技术，以及分别用于监测单个游离寡糖或糖蛋白的“自下而上”方法。此外，还可采用“自中而下”策略来评估mAb亚基的主要糖型。后一种方法在生产环境中尤其有用，在这种环境下，该方法能够以经济有效的方式及时报告糖基化分布的变化并进行纠正。 ACQUITY QDa质谱检测器是一款经济有效的工具，可用作正交检测技术，为现有LC工作流程增加获取质谱数据的功能。本研究旨在评估将ACQUITY QDa质谱检测器应用于亚基分析的适用性。曲妥珠单抗是一种IgG1抗体，可以被二硫苏糖醇(DTT)还原为大约25kDa的轻链和大约50 kDa的重链肽段(图1A)。采用MassLynx软件进行数据采集，能够通过MaxEnt1去卷积算法解析复杂的谱图，以便测定各个亚基的分子量。IdeS酶解和还原可产生三种肽段，每种肽段约25kDa(图1B)。由于IdeS酶解会使得抗体铰链区的单个位点处发生专属性的高效裂解，因此它成为了治疗性mAb的常用表征工具之一，而在本例中，我们将其作为监测主要糖型的一种替代方法。 图1.亚基的形成。1A)使用DTT进行部分原，使得连接重链(HC)和轻链(LC)的键被还原。1B)IdeS酶解和还原，可得到三种肽段： Fc/2、LC和Fd，每种肽段的大小约为25kDa。糖基化修饰发生在Fc区域，因此，对重链或Fc/2肽段进行质谱检测即可监测糖基化修饰谱图。 结果与讨论 为了获得曲妥珠单抗的轻链和重链数据，按照前文所述的方法对抗体进行部分还原。光谱图如图2A所示。为了测定每种肽段的质量数，利用MassLynx软件的MaxEnt1算法将质谱数据去卷积为零电荷态。使用统一高斯模型将MaxEnt1分辨率设置为0.5 Da/通道，峰宽0.7Da。从目标峰的中间到基线部分对谱图进行合并。所用刊最大迭代次数为20，以避免过度处理数据。图2B和图2C分别为轻链和重链亚基的去卷积谱图。轻链去卷积使得电荷包络坍缩为单个峰，而重链去卷积鉴定出了四种主要糖型。 图2.曲妥珠单抗的部分还原。2A)为光谱图，展示了轻链(LC)和重链(HC)肽段的分离结果。2B)和2C)为ACQUITYQDa质谱检测器采集到的对应质谱数据。利用MaxEnt1算法对轻链和重链肽段进行去卷积。轻链坍缩为单电荷态，而重链则包含四种糖型。 由于ACQUITYQDa质谱检测器的质量数范围为30-1250m/z， 轻链和重链的低电荷态均超出了这一检测窗口。图3叠加了根据ACQUITY QDa数据得到的轻链电荷包络与采用扫描范围更宽的高清MS得到的模拟电荷包络。从叠加谱图中可以看到， ACQUITYQDa数据仅仅是高清仪器产生的电荷包络的一部分。为了确定这种关系对质量数测定的影响，我们在表1中列出了由MaxEnt1生成的轻链和重链结果，并将其报告为实验质量数，并与理论平均分子量进行了对比。 图3.轻链电荷包络的叠加谱图。 ACQUITYQDa质谱检测器的结果(蓝色)覆盖了高清MS生成的电荷包络(虚线)的一部分。ACQUITYQDa数据包括+19-+24电荷态。 IdeS酶解和还原 轻链 重链 Fc/2 G0 GOF G1F G2F G0 GOF G1F G2F 平均质量数(Da) 23439.1 50447.7 50593.8 50756.0 50918.1 25090.2 25236.3 25398.4 25560.6 实验质量数(Da) 23440.5 50454.5 50600.0 50761.5 50925.0 25090.0 25235.0 25397.5 25560.0 △质量数(Da) 1.4 6.8 6.2 5.5 6.9 -0.2 -1.3 -0.9 -0.6 质量精度(ppm) 60 135 123 108 136 -8 -52 -35 -23 表1.部分还原曲妥珠单抗和经过/deS酶解并还原的曲妥珠单抗的实验质量数(使用MaxEnt1进行去卷积所得)与理论平均分子量对比。质量精度的计算方法为(△质量数/平均质量数)*10°。 仪器造成的质量误差与电荷态成正比，较大的误差与较高的电荷态有关。以+19-+50的电荷态为例，这个范围涵盖了使用ACQUITYQDa质谱检测器采集到的轻链和重链电荷包络对应的电荷态范围，与这些电荷态相关的仪器质量误差在±3.8 Da-±10 Da范围内(±0.2×电荷态)。如果考虑曲妥珠单抗的轻链，其电荷态在+19-+24范围内，预期质量精度为150 ppm-200 ppm。由于报告的轻链实验质量精度为60 ppm(表1)，该值显然在仪器的预期范围内。同样地，重链的质量精度应在150-200ppm范围内，而所有肽段都满足此标准(表1)。 为了进一步测试ACQUITY QDa质谱检测器在亚基分析中的适用性，我们采用常用的IdeS酶，通过第二种方法生成亚基片段。通过IdeS酶解和还原，产生了三种肽段(Fc/2、LC和Fd')，每种肽段的大小约为25kDa。图4A展示了经IdeS酶解和还原后的曲妥珠单抗样品的光谱图，三种肽段清晰地彼此分离。图4B展示了包含糖基化修饰位点的Fc/2肽段的去卷积质谱数据，图中展示了之前从重链数据中鉴定出的四种糖型。表1报告了来自Fc/2肽段的糖型的质量精度，结果均处于仪器的预期范围内。与部分还原类似， ldeS酶解和还原也能对目标产品进行确证，还能更轻松地确定生产过程中发生的变化。 图4.曲妥珠单抗的/deS酶解和还原。4A)为光谱图，展示了Fc/2、LC和Fd肽段的分离结果。4B)为ACQUITY QDa质谱检测器采集到的对应质谱数据。通过去卷积鉴定出了四种Fc/2糖型。 本研究证明， 使用ACQUITY QDa质谱检测器，，可通过两种不同的方法可靠地进行亚基水平的质量数测定。将曲妥珠单抗样品部分还原，得到完全处于仪器预期质量精度限以内的轻链和重链肽段。通过ldeS酶解和还原，获得具有较低电荷态的小分子抗体亚基片段。通过监测约50kDa的重链肽段以及IdeS酶解和还原所得的Fc/2肽段(约25kDa)的主要糖型，我们对比了两种处理方法所得的结果，这两种方法均通过ACQUITY QDa质谱检测器进行了快速有效亚基数据采集，最终可应用于验证产品一致性和产品成分的筛查方案中。 ( 1. Raju T.S. and Jordan R.E. Galactosylation variationsin marketed t herapeutic antibodies.mAbs. 2012. 4(3)：385-391. ) 扫一扫，关注沃特世微信 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters、 The Science of What’s Possible、ACQUITY、MassLynx、ACQUITY UPLC和QDa是沃特世公司的注册商标。MaxEnt是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 @2016年沃特世公司。中国印刷。2016年5月720005707ZH AG-PDF 沃特斯中国有限公司沃特世科技(上海)有限公司 成都：028-67653588 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400) 820 2676Www.waters.com 对单克隆抗体亚基进行工艺监测以快速监测关键品质属性 本研究旨在评估将ACQUITY QDa质谱检测器应用于亚基分析的适用性。曲妥珠单抗是一种IgG1抗体，可以被二硫苏糖醇(DTT)还原为大约25 kDa的轻链和大约50 kDa的重链肽段。采用MassLynx软件进行数据采集，能够通过MaxEnt1去卷积算法解析复杂的谱图，以便测定各个亚基的分子量。IdeS酶解和还原可产生三种肽段，每种肽段约25 kDa。由于IdeS酶解会使得抗体铰链区的单个位点处发生专属性的高效裂解，因此它成为了治疗性mAb的常用表征工具之一，而在本例中，我们将其作为监测主要糖型的一种替代方法。