血浆中使用Oasis PRiME MCX高效萃取血浆中的喹硫平检测方案(液相色谱仪)

「应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要 使用Oasis PRiME MCX高效萃取血浆中的喹硫平 Michelle Wills1、Lisa J. Calton1、Gareth Hammond1、Kim Haynes?1沃特世公司(英国威姆斯洛)2沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 应用优势 更快速、更简单的样品制备工作流程 与蛋白沉淀法相比，可去除至少98%的磷脂 无需蒸发或复溶 沃特世解决方案 Oasis PRiME MCX uElution板 ACQUITYUPLC°I-Class系统(FTN) ACQUITY CSHC色谱柱 Xevo° TQD质谱仪MassLynx软件 Oasis MCX uElution板 关键词 Oasis PRiME MCX， SPE， 喹硫平， 磷脂去除， LC-MS/MS 简介 生物分析在药物发现和开发中发挥着重要作用，其中样品制备是获得可靠结果的关键步骤1。为实验室开发高通量分析方法时，分析速度、方法稳定性和成本是必须考虑的重要因素。 Oasis PRiME MCX是一款混合模式/强阳于子交换固相萃取(SPE)产品，相较于其它样品制备技术，该产品可通过去除磷脂萃取出更洁净的碱性化合物。在本应用纪要中，我们使用96孔pElution板，通过快速的3步方案(省去了传统固相萃取法(SPE)的活化和平衡步骤)成功萃取了人血浆中的喹硫平。 喹硫平的结构如图1所示。喹硫平为二苯并硫氮杂卓衍生物，是一种用于治疗多种精神障碍的抗精神病药物。阳离子交换吸附剂是萃取这种碱性药物(胺的pKa为7.06)的理想之选。 图1.喹硫平的结构。 在本应用纪要中，我们使用三种样品萃取方案(蛋白沉淀法、Oasis MCX和Oasis PRiME MCX)对喹硫平进行分析，比较了三种方法中的分析物回收率和基质效应(包括磷脂去除率)。 实验 样品制备 将喹硫平(Sigma Aldrich， 英国多塞特郡)加标至混合人血浆(Sera Laboratories， 英国西萨塞克斯郡)中，制得浓度在2.5~100 ng/mL范围内的样品。此外，自制浓度为7.5 ng/mL、30 ng/mL和75 ng/mL的QC样品。 样品制备 1.蛋白沉淀法 移取100pL血浆校准品/QC样品至带刻度的微量离心管中。 加入300 uL甲醇，使蛋白质沉淀。离心管加盖涡旋30s， 然后在13000rpm的转速下离心5 min。 2.Oasis MCX 移取100uL血浆校准品/QC样品至带刻度的微量离心管中。向每个样品中加入100 uL4%磷酸，以破坏蛋白质结合，同时使分析物质子化，促进离子交换相互作用。离心管加盖涡旋30s， 然后在13000 rpm的转速下离心5 min。 将上清液转移至已经过甲醇活化并用水进行了平衡的Oasis MCX 96孔uElution板中。然后依次用2%甲酸水溶液和100%甲醇清洗萃取板。再用2x25uL 5%氨化甲醇溶液洗脱，最后用50uL水稀释洗脱液。在分析之前，将样品板密封并轻轻涡旋30 s. 3. Oasis PRiME MCX 移取100pL血浆校准品/QC样品至带刻度的微量离心管中。向每个样品中加入100 uL 200 mM 甲酸铵(含4%磷酸)，以破坏蛋白质结合，同时使分析物质子化，促进离子交换相互作用。离心管加盖涡旋30s， 然后在13000 rpm的转速下离心5 min。将上清液转移至Oasis PRiME MCX 96孔uElution板中，并用100%甲醇进行清洗。然后用2x 25 uL 5%氨化甲醇溶液洗脱，最后用50uL水稀释洗脱液。在分析之前，将样品板密封并轻轻涡旋30 s。 固相萃取步骤汇总于图2. 图2.与传统SPE萃取方案比较， Oasis PRiME MCX方案由于省去了活化和平衡步骤，被简化为仅有3步。 LC条件MS条件LC系统：ACQUITY UPLC I-Class系统(FTN)系统： Xevo TQD色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C，。分辨率： MS1和MS2 (0.75 FWHM)1.7 pm，2.1x100 mm采集模式： 多重反应监测(MRM)(详见表2)(部件号186005297)极性： ESI+流动相A：0.1%甲酸水溶液：毛细管电压： 0.5 kV流动相B：甲醇锥孔电压： 见表2清洗溶剂：80%甲醇水溶液和0.1%甲酸离子源温度： 150°℃清除溶剂：20%甲醇水溶液和0.1%甲酸脱溶剂气温度 600°℃密封清洗液：20%甲醇水溶液驻留时间： 0.05s柱温：45°℃扫描间延迟时间：0.02s样品温度：10℃通道间延迟时间：0.01s进样体积：5pL流速：0.4mL/min表2.喹硫平定性离子和定量离子的MRM参数指导值。梯度：见表1 运行时间： 4.3 min(两次进样之间约5.0 min) 表1.用于分离喹硫平的梯度表。 时间 (min) 流速 (mL/min) %A 9B 曲线 初始 0.4 90 10 初始 3.00 0.4 5 95 6 3.50 0.4 90 10 11 分析物 母离子 子离子 锥孔电压 碰撞能量 (m/z) (m/z) 喹硫平 (定量离子) 384.1 253.05 40 30 喹硫平 (定性离子) 384.1 221.1 40 45 数据管理带TargetLynx"定量应用软件的MassLynx 4.1版。 结果与讨论 回收率 分析代表了整个浓度范围的三个样品，每个样品重复分析6次，以确定蛋白沉淀法、Oasis MCX和Oasis PRiME MCX样品萃取法的萃取回收率。使用如下公式计算萃取回收率： 其中，A是萃取样品的峰面积，B是萃取基质样品(在萃取之后加入喹硫平)的峰面积。如表3所示， 使用Oasis MCX(平均回收率94.5%)和Oasis PRiME MCX(平均回收率94.0%)时，各个浓度的样品都获得了优异的喹萃平萃取回收率和精度，然而，蛋白质沉淀法的回收率非常差(平均回收率仅为27.7%)。 表3.蛋白沉淀法(PPT)、Oasis MCX和Oasis PRiME MCX方案的精度(%RSD)和萃取回收率(%回收率)。 PPT Oasis MCX Oasis PRiME MCX 回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD QC低浓度 25.6% 2.0% 97.8% 3.5% 96.7% 8.5% QC中等浓度 27.8% 1.2% 94.2% 5.3% 94.6% 4.6% QC高浓度 29.6% 0.8% 91.3% 3.0% 90.8% 4.4% 基质效应和磷脂去除 分析代表了整个浓度范围的三个样三，每个样品重复分析6次，以确定蛋白沉淀法、Oasis MCX和Oasis PRiME MCX样品萃取方案的基质效应。使用如下公式计算基质效应： “存在基质时的峰面积”是指在萃取之后加入喹硫平制得的萃取基质样品的峰面积。 “无基质时的峰面积”是指用溶剂配制的喹硫平溶液的峰面积。 使用蛋白沉淀法时，观察到显著的基质效应；平均基质效应为-58.4%(在-56.4%~-59.6%范围内)，这表示存在严重的离子抑制。使用混合模式/强阳离子交换固相萃取时，观察到的基质效应可以忽略不计，其中Oasis MCX的平均基质效应为-2.7%(在0~-4.3%的范围内)，而Oasis PRiME MCX的平均基质效应为-0.1%(在-1.9%~1.2%的范围内) 为了评估磷脂去除率，我们进行了母离子扫描实验，对三种萃取方案所得的血浆样品萃取物中m/z184离子的母离子进行监测。以磷脂含量最高的蛋白质沉淀法萃取物为基准，对磷脂峰面积进行归一化处理。图3比较了蛋白质沉淀法、Oasis MCX和3步OasisPRiME MCX方案得到的血浆样品萃取物中的磷脂浓度，结果表明3步Oasis PRiME MCX方案的磷脂去除率高达98%，远高于蛋白沉淀法。 图3.使用蛋白沉淀法、Oasis MCX和Oasis PRiME MCX得到的萃取血浆样品中磷脂含量的柱形图。 与蛋白白淀法相比，配合3步法的Oasis PRiME MCX方案去除了98%的磷脂，而且结果重现性优异，所得萃取物更洁净，基质效应可忽略不计。 尽管蛋白沉淀法是一种低成本的样品制备方法，但该方法的基质效应显著，因此样品净化效率可能较差，进而会影响生物分析方法的稳定性。 uElution板采用精简的3步法方案，所得的血浆萃取物无需蒸发和复溶即可直接进样分析，为分析人员提供了一个快速的工作流程。该方法采用SPE规格的装置和萃取方案，可使用自动化液体处理设备轻松实现自动化，从而改进实验室工作流程，消除人为错误并实现样品追踪功能。 扫一扫，关注沃特世微信 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters、 The Science of What’s Possible、Oasis、ACQUITY、UPLC、MassLynx和Xevo 是沃特世公司的注册商标。TargetLynx是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 ( 1. Mohammad MaHDI Moeina， Az i za El Beqqalib，Mohamed Abdel-Rehimb. Bioanalytical methoddevelopment and validation： C r itical concepts and strategies.JChromatography B. 2017；1043：3-11. ) 使用Oasis PRiME MCX高效萃取血浆中的喹硫平 使用Oasis PRiME MCX高效萃取血浆中的喹硫平 在本应用纪要中，我们使用三种样品萃取方案(蛋白沉淀法、Oasis MCX和Oasis PRiME MCX)对喹硫平进行分析，比较了三种方法中的分析物回收率和基质效应(包括磷脂去除率)。