红细胞膜中膜磷脂检测方案(离心机)

来亨科学仪器Laiheng Lab-Equipment 膜磷脂的分析 一、实验原理 膜中脂类的主要组分是磷脂和胆固醇，磷脂为含磷酸与氨碱的单脂衍生物，可分甘油磷脂及鞘氨醇磷脂两类，它们在生命活动中有重要作用。 用甲醇-Trichloromethane 可将生物膜中的脂类组分提取出来。 二、实验用品 (一)器材 (1)具塞试管。 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 景盛南二街33号4号楼4层 (2)普通离心机。 (3)15cmx15cm玻璃板。 (4)薄层层析展层缸。 (5)定磷用的全套器材。 (二)试剂 (1)硅胶H-碱式碳酸镁混合物：称取97g薄层层析用硅胶H， 3g碱式碳酸镁置研钵中研磨，并混合均匀。 (2)硅胶H-碱性硅酸镁混合物：称取98g薄层层析用硅胶 H， 2g碱性硅酸镁置研钵中研磨，并混合均匀。 (3)称取磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，神经鞘磷脂，卵磷脂等各5mg， 溶于10mlTrichloromethane：甲醇中。 (4)有机溶剂氯仿、甲醇、乙酸。 (5)氨水。 (6)碘。 (7)高氯酸。 (8)定磷试剂。 (三)材料 红细胞膜。 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 三、实验程序 1.膜脂类的提取 将冰冻干燥的膜制品总重量的一半悬浮于 0.8ml 等渗的磷酸盐缓冲液中，加3mlTrichloromethane：甲醇，盖上试管塞，剧烈振荡最少1min，另外，再加1mlTrichloromethane振荡 1min，最后加1ml水振荡 1min。用台式离心机低速离心5min，在离心管里分相，缓缓地吸去上相，用细头滴管穿过两相界面处变性蛋白的薄层，吸出下相液，转移到一个已知重量的小烧杯内，置真空干燥器内，用水泵抽气，使溶液蒸发至干。称重。记录脂类类提物的重量。 2.磷脂的分析 1、硅胶板的规格及制作方法：准备几块15cmx15cm 的玻璃板，洗净。烘干或滴上几滴乙醇，用清洁的纱布擦干。 取3g硅胶H-碱式碳酸镁混合物或硅胶H-碱性硅酸镁混合物，置于水平台面上，使其自然干燥，然后放在110℃烘箱内活化 30min，贮于真空干燥器内备用。 2、点样：用200pLTrichloromethane-甲醇溶解 2mg 干燥的脂类。取100pL溶解的样品溶液，点在距板的边缘约 2cm处薄层板的一个角上，点样的面积要小，待样品干燥后再点一次，如此重复。 另取一块薄层板，依同样位置点上磷脂的标准样品混合液。 3、展层：采用倾斜上行法展层。展层缸内新配制的溶剂系统平衡，进行双相层析。每相展层约需2h， 当溶剂前沿距板的顶端2~3cm时，取出薄层板，用铅笔画出溶剂前 ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) 沿位置，干燥。第一相展层后，取出，在空气中干燥约 15min， 若空气湿度太大时，则须在放有硫酸干燥哭喊内干燥0.5h。 4、显色及定位：将干燥后的薄层板放入碘缸内，盖好。升华的碘与磷脂发生加成反应，而使磷脂的斑点呈现黄色或棕色。 斑点显现后，参参磷脂标准样品的相对位置及 Rf 值鉴别红细胞膜中含有那几种磷脂。 北京来亨科学仪器有限公司 ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) 技术中心：北京金桥科技产业基地 景盛南二街33号4号楼4层 北京来亨科学仪器有限公司技术中心：北京金桥科技产业基地   一、实验原理 膜中脂类的主要组分是磷脂和胆固醇，磷脂为含磷酸与氨碱的单脂衍生物，可分甘油磷脂及鞘氨醇磷脂两类，它们在生命活动中有重要作用。 用甲醇-Trichloromethane可将生物膜中的脂类组分提取出来。 二、实验用品  （一）器材 （1）具塞试管。 （2）普通离心机。 （3）15cm×15cm玻璃板。 （4）薄层层析展层缸。 （5）定磷用的全套器材。   （二）试剂  （1）硅胶H-碱式碳酸镁混合物：称取97g薄层层析用硅胶H，3g碱式碳酸镁置研钵中研磨，并混合均匀。（2）硅胶H-碱性硅酸镁混合物：称取98g薄层层析用硅胶H，2g碱性硅酸镁置研钵中研磨，并混合均匀。（3）称取磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，神经鞘磷脂，卵磷脂等各5mg，溶于10mlTrichloromethane:甲醇中。     （4）有机溶剂氯仿、甲醇、乙酸。     （5）氨水。     （6）碘。     （7）高氯酸。     （8）定磷试剂。 （三）材料     红细胞膜。 三、实验程序   1.膜脂类的提取     将冰冻干燥的膜制品总重量的一半悬浮于0.8ml等渗的磷酸盐缓冲液中，加3ml Trichloromethane:甲醇，盖上试管塞，剧烈振荡最少1min，另外，再加1mlTrichloromethane振荡1min,最后加1ml水振荡1min。用台式离心机低速离心5min,在离心管里分相，缓缓地吸去上相，用细头滴管穿过两相界面处变性蛋白的薄层，吸出下相液，转移到一个已知重量的小烧杯内，置真空干燥器内，用水泵抽气，使溶液蒸发至干。称重。记录脂类抽提物的重量。 2.磷脂的分析(1)硅胶板的规格及制作方法：准备几块15cm×15cm的玻璃板，洗净。烘干或滴上几滴乙醇，用清洁的纱布擦干。      取3g硅胶H-碱式碳酸镁混合物或硅胶H-碱性硅酸镁混合物，置于水平台面上，使其自然干燥，然后放在110℃烘箱内活化30min,贮于真空干燥器内备用。(2)点样：用200µLTrichloromethane-甲醇溶解2mg干燥的脂类。取100µL溶解的样品溶液，点在距板的边缘约2cm处薄层板的一个角上，点样的面积要小，待样品干燥后再点一次，如此重复。另取一块薄层板 ，依同样位置点上磷脂的标准样品混合液。(3)展层：采用倾斜上行法展层。展层缸内新配制的溶剂系统平衡，进行双相层析。每相展层约需2h，当溶剂前沿距板的顶端2~3cm时，取出薄层板，用铅笔画出溶剂前沿位置，干燥。第一相展层后，取出，在空气中干燥约15min，若空气湿度太大时，则须在放有硫酸干燥哭喊内干燥0.5h。(4)显色及定位：将干燥后的薄层板放入碘缸内，盖好。升华的碘与磷脂发生加成反应，而使磷脂的斑点呈现黄色或棕色。 斑点显现后，参考磷脂标准样品的相对位置及Rf值鉴别红细胞膜中含有那几种磷脂。